期刊论文新型冠状病毒疫苗研发进展及分析_康庄

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　·新型冠状病毒肺炎·新型冠状病毒疫苗的研发进展及分析康庄 1, 2 　综述 唐梅 1 　审校1. 乐山师范学院 生命科学学院（四川乐山 614000）2. 成都生物制品研究所有限责任公司 生物技术研究室（成都 610000）【摘要】

　 随着新型冠状（简称：新冠）病毒疫情在全球愈演愈烈，越来越多的人们将疫情遏制的希望寄托于新冠病毒疫苗的研发。目前全球已经有多个研究团队，采用了不同的疫苗开发技术路线开展新冠病毒疫苗的研发。本文对目前不同路线新冠疫苗的开发与研究现状进行了综述和分析，同时也探讨了这些不同疫苗今后发展的可能性。【关键词】

　新型冠状病毒；灭活疫苗；减毒活疫苗；重组蛋白疫苗；核酸疫苗Progress and analysis on the development of 2019-nCoV vaccineKANG Zhuang

　1, 2 ,

　TANG mei

　11. College of Life Science, Leshan Normal University, Leshan, Sichuan 614000, P.R.China2. Department of Biotechnology, Chengdu Institute of Biological Products, Chengdu 610000, P.R.ChinaCorresponding author: KANG Zhuang, Email: crazy.kz@163.com【Abstract】

　As the COVID-19 pandemic is intensifying globally, more and more people are pinning their hopes onthe development of vaccines. At present, there are many research teams who have adopted different vaccine technologyroutes to develop 2019-nCoV vaccines. This article reviews and analyzes the current development and research status of2019-nCoV vaccines in different routes, and explores their possible development in the future.【Key words】

　2019-nCoV; inactivated vaccine; attenuated live vaccine; recombinant protein vaccine; nucleic acidvaccine引言新型冠状（简称：新冠）病毒（2019 novelcronavirus，2019-nCoV），是继严重急性呼吸道综合症（severe acute respiratory syndrome，SARS）冠状病毒（SARS coronavirus，SARS-CoV）和中东呼吸综合症冠状病毒（Middle East respiratory syndromecoronavirus，MERS-CoV）后，出现的第三个人群间突发传播的冠状病毒 [1-3] 。随着全球新冠病毒肺炎相关疾病（coronavirus disease 2019，COVID-19）的患者激增，COVID-19 已经成为全球性大流行病，在尚无特效药物的情况下，短期内研发并尽快使用新冠病毒疫苗是阻止疫情全球化蔓延的有力手段。新冠病毒与其他冠状病毒类似，由四个结构蛋白组成，分别是刺突蛋白（spike，S）、包膜蛋白（envelope，E）、膜蛋白/基质蛋白（membrane/matrix，M）和核衣壳蛋白（nucleocapsid，N）

　[4-5] 。S蛋白通过位于 S1 亚基上的受体结合区（receptorbinding domain，RBD）与宿主细胞表面的血管紧张素转化酶 2（angiotensin-converting enzyme 2，ACE2）受体结合，从而进入人体细胞，导致发烧、肺部感染等疾病 [6-7] 。因为针对病毒 S 蛋白的中和抗体可阻断病毒侵入宿主细胞 [8] ，所以目前在研的大多数新冠疫苗都是以 S 蛋白为主要抗原进行设计开发的。截止 2020 年 4 月，全球范围内已经公开了上百个新冠病毒疫苗开发项目 [9] 。按照不同研发途径和思路以及相关特点，本文将逐步展开介绍，并辅以概括性的归纳和分析，希望为未来的突发流行病疫苗开发提供一些参考。1 灭活疫苗路线灭活病毒疫苗是在细胞基质上对病毒进行培养，然后用物理（加热）或化学（通常采用甲醛溶液DOI：10.7507/1001-5515.202004025通信作者：康庄，Email：crazy.kz@163.com生物医学工程学杂志 2020年6月第37卷第3期 • 373 •http://www.biomedeng.cn

　或者 β-丙内酯）的方法将具有感染性的完整病毒杀死，使其失去致病力而保留抗原性。常见的病毒类灭活疫苗，比如狂犬疫苗、灭活脊灰疫苗、流感疫苗以及我国率先研发并上市使用的手足口病疫苗，也称肠道病毒 71 型疫苗（enterovirus type 71，EV71）等，都是采用类似的技术路线 [10-11] 。此前国内曾有团队研发针对 SARS-CoV 的灭活疫苗，并完成了Ⅰ期临床试验，证明所获得的冠状类病毒灭活疫苗的人体安全性，同时能够 100% 诱导产生中和抗体 [12] 。目前，中国生物技术股份有限公司旗下两个子公司：武汉生物制品研究所有限责任公司和北京生物制品研究所有限责任公司，以及北京科兴生物制品有限公司等三个团队的灭活新冠病毒疫苗，现都已进入了临床试验阶段 [13-15] 。灭活疫苗研发路线相对成熟，只要成功分离并筛选出免疫原性合格且可以在细胞上进行培养的毒株，并能够应用于规模化生产即可。此外，灭活疫苗质控点和评价方法也比较明确，而且通常都有较好的安全性和免疫原性 [10] 。但利用灭活疫苗技术路线开发新冠病毒疫苗仍然存在不足之处，主要存在以下几点：① 是毒株的分离和培养、相关研究评价工作以及后面的生产都存在一定的生物安全风险，对实验室或者生产车间的生物安全级别要求高，一般要求为生物安全三级；② 是灭活疫苗尽管工艺成熟度高，但是由于生产过程需要进行细胞和病毒培养、建立毒株以及作为基质的细胞株的多级种子库，因此在生产阶段实现产能迅速放大（数千万剂/年）存在一定难度；③ 是灭活疫苗往往需要多次接种才能产生有足够保护力的抗体，在作为应急疫苗使用时有所不足。2 减毒活疫苗路线减毒活疫苗是从野生株或致病病毒衍生而来的，经典的毒株筛选方法是将相应的野生病毒在实验室经反复传代，逐步获得对人体致病力大大降低的减毒株；当人体接种较小剂量的减毒株时，即可在体内产生良好的免疫反应。目前，此类常见的病毒类减毒株活疫苗也很多，比如：脊灰减毒活疫苗、麻腮风疫苗、水痘疫苗以及我国第一个出口海外的拥有自主知识产权的疫苗——乙型脑炎减毒活疫苗等 [16] 。减毒活疫苗优点在于：① 可模拟病毒的自然感染，免疫效果好，免疫应答速度快，既可产生体液免疫，也可产生细胞免疫，往往只接种一剂次就可使机体产生良好的免疫应答；② 生产成本不高，相比灭活疫苗更易量产。不过，减毒活疫苗的缺点也非常明显：① 研发时间长，合格疫苗候选株的筛选往往需要经多种细胞且多次传代，有的还需低温下细胞传代；② 毒株关键指标——残余毒力评估难度较大；③ 即使减毒活疫苗研发成功，在后续使用过程中也存在疫苗衍生株传播疾病的可能性，即减毒活疫苗株在极个别接种者（往往是免疫功能缺陷者）体内发生变异重组后，导致未接种疫苗者感染患病 [17] ；④ 与灭活疫苗相似，减毒活疫苗的研发及生产涉及病毒培养，对生物安全要求相对较高，存在一定生物安全风险。由于传统减毒传代的筛选方式费时费力，近年疫苗开发已经鲜有应用。针对目前疫情的紧急状态，新冠减毒株的研发选择传代减毒策略的可能性很小。而从另一种角度考虑，比如 Lam 等 [18] 发现新冠病毒与穿山甲体内的某个冠状病毒受体结合域（receptor binding domain，RBD）氨基酸序列相似性高达 97.4%，就像 17 世纪时詹纳（Jenner）医生利用牛痘预防天花那样 [19] ，如果能从已经发现的动物冠状病毒中，找到免疫后对新冠病毒有交叉保护作用同时无人体致病性的毒株，可以尝试作为疫苗候选株进行继续的评价和开发。此外，利用反向遗传学技术，对新冠病毒进行定点的基因突变或者缺失，快速获得不致病且免疫原性好的疫苗候选株，也是值得尝试的思路。曾经有科学团队尝试通过对病毒 E 蛋白基因进行定点缺失和突变操作，其开发的 SARS-CoV 减毒株被证明可在小鼠上诱导产生体液和细胞免疫，并且能够保护其免受 SARS-CoV的攻击 [20-22] 。3 重组蛋白疫苗路线相比于传统的灭活和减毒路线，重组蛋白疫苗以其安全性好、低成本等优势成为近年来疫苗研发的热门方向。其过程是，基于已发布的病毒基因序列，将病毒目的抗原基因构建在表达载体上，再转化到细菌、酵母、哺乳动物或昆虫细胞中，诱导表达出抗原蛋白，最后纯化后制成疫苗。常见的重组蛋白疫苗有乙肝疫苗和宫颈癌疫苗——人乳头瘤病毒疫苗，以及中国率先研制的戊肝疫苗等。新冠病毒表面抗原 S 蛋白具有天然三聚体结构，成都三叶草公司利用其 Trimer-Tag©（蛋白质三聚体化）专利技术，在哺乳动物细胞内表达、纯化，得到与新冠病毒天然表面抗原 S 蛋白构象高度相似的共价三聚体融合蛋白——“S-三聚体”，同• 374 • Journal of Biomedical Engineering, Jun. 2020, Vol. 37, No.3 http://www.biomedeng.cn

　时试验证明该“S-三聚体”抗原可以与病毒感染患者康复后血清中的特异性抗体结合 [23] 。重组蛋白疫苗技术路线最大的优点是：① 安全性高，除了部分评价工作，生产及研发无需高等级生物安全实验室；② 疫苗生产的工艺路线确定后，易于大规模生产。但由于是利用不同表达系统表达病毒部分蛋白作为抗原，所表达蛋白三维结构与病毒蛋白天然构象可能存在差异，所以免疫原性是否足够，往往是重组蛋白路线能否成功的关键。为了解决免疫原性的问题，病毒类重组蛋白疫苗通常利用病毒样颗粒（virus-like particles，VLP）构建技术，让重组蛋白自组装成一个类病毒颗粒以增强其免疫原性，之前提到的乙肝疫苗、人乳头瘤病毒疫苗、戊肝疫苗都是如此 [24] 。也有成功案例是利用疫苗佐剂达到辅助增强疫苗效果的目的，比如利用铝佐剂吸附（乙肝疫苗、人乳头瘤病毒疫苗）；或者是更优效的复合免疫刺激佐剂，比如葛兰素史克公司（GlaxoSmithKline，GSK）的重组带状疱疹病毒疫苗就是利用表达带状疱疹病毒 E 蛋白与该公司拥有专利技术的佐剂系统联合使用，取得了良好的临床效果 [25] 。2020 年 4 月 3 日，GSK 公司和厦门万泰沧海生物技术有限公司（简称：厦门万泰）联合宣布开展研究合作，GSK 将向厦门万泰提供疫苗佐剂系统，以评估厦门万泰与厦门大学开发的重组蛋白冠状病毒候选疫苗的临床前效果 [26] 。4 病毒载体疫苗路线病毒载体疫苗，是使用活病毒（通常为仍具备复制活性的减毒株，或者是非复制型病毒）作为载体，将编码外源性抗原的基因通过病毒载体呈递到宿主细胞，使得抗原在宿主中进行表达并诱导产生相应的免疫应答。自从 20 世纪 80 年代以来，研究发现多种病毒可以作为疫苗载体，包括腺病毒、细小病毒（如腺相关病毒）、副粘病毒（如麻疹病毒、新城疫病毒或人副流感病毒）、弹状病毒（如水疱性口炎病毒）和痘病毒（如重组牛痘安卡拉病毒）

　[27] 。目前已经上市的预防用载体病毒疫苗不多，都未能得以大规模应用，比如黄热病毒减毒株17D 为基因骨架构建的重组登革热疫苗 Dengvaxia [28] 。2019 年底，欧盟和美国食品药品监督管理局（foodand drug administration，FDA）批准了默沙东公司生产的以重组水疱性口炎病毒为载体的埃博拉疫苗 ERVEBO（rVSVΔG-ZEBOV-GP）上市，上市前该疫苗在 III 期临床中取得较为满意的结果 [29] 。中国人民解放军军事科学院（简称：军科院）军事医学研究院和天津康希诺生物股份公司（简称：康希诺）合作开发的重组埃博拉病毒疫苗于 2017 年在中国获批，是利用腺病毒 Ad5 为载体开发的预防埃博拉病毒感染的疫苗 [30] 。2020 年 3 月 16 日，军科院院士陈薇和康希诺公司联合研制的重组新型冠状病毒疫苗（腺病毒载体）的Ⅰ期临床试验已经在武汉开展 [31] ，现已完成了 14 天的初步安全性观察，并于 4 月 12 日开展Ⅱ期临床试验 [32] 。英国牛津大学詹纳研究所同样利用腺病毒载体技术开发的新冠病毒疫苗于 4 月23 日也开始进行Ⅰ期临床试验 [33] 。法国巴斯德研究所利用改良后的麻疹疫苗株作为载体，表达新冠病毒抗原基因的相关研发也在进展之中。此外，麻疹病毒能容纳多个外源基因，不会与宿主基因组整合，因此安全性高，可被开发用于重组病毒载体疫苗。利用麻疹病毒开发针对基孔肯雅病毒的载体疫苗已经完成了Ⅱ期临床试验 [34] ，而利用麻疹病毒开发的 MERS-CoV 载体疫苗免疫小鼠后在攻毒试验中也证明其确实具有保护效果 [35] 。病毒载体疫苗路线具备减毒活疫苗部分优点，比如病毒载体本身可诱导产生强烈免疫应答（体液免疫和细胞免疫），因此通常不需要使用额外的佐剂。此外病毒载体疫苗的接种可以考虑不同的途径，除肌肉接种外，鼻腔接种、皮内接种和口服接种都可以考虑，作为应急疫苗使用，给药途径易于实施。本技术路线短板在于，某些载体病毒可能存在潜在的宿主基因组整合能力，这一点需要在临床研究开始之前和研究期间仔细评估。而且如果病毒载体是来自能够感染人的病毒，比如麻疹、流感、腺病毒，都可能因为接种者原有的中和抗体或者免疫记忆，对病毒载体免疫原性产生影响，从而最终影响疫苗的保护效果 [36] 。5 核酸疫苗路线（DNA 疫苗/mRNA 疫苗）基于核酸的疫苗技术路线是使用编码抗原的质粒 DNA 或 mRNA被细胞摄取后表达抗原蛋白，从而诱导机体产生体液免疫和细胞免疫。核酸疫苗路线支持各种抗原的递送，可以利用平台化的技术开发多种病原体的疫苗。疫苗的生产与编码的蛋白质特性无关，因此不同的疫苗所需生产、纯化和验证方法都是相同的，更重要的是核酸疫苗的生产原料主要依赖于化学合成，大规模生产更容易；不同核酸疫苗制造所需的设施设备相同，研发、生产和生产线建设相对其他技术路线，所需时间大大减少。核酸疫苗路线的两大技术（DNA 疫苗/生物医学工程学杂志 2020年6月第37卷第3期 • 375 •http://www.biomedeng.cn

　mRNA 疫苗）非常适合开发应对 COVID-19 这种突发的紧急传染病的疫苗。5.1 DNA 疫苗DNA 疫苗通常是通过将编码目的抗原的真核表达元件插入质粒而成。20 世纪 90 年代的 DNA疫苗研究中，最常见的给药途径是肌内或...