雄性不育大白菜小孢子败育与花蕾长度的关系

摘要：以复等位基因遗传的大白菜雄性不育两用系ＡＢ０１为材料，对蕾长与小孢子发育动态关系进行研究。形态调查结果发现，花蕾发育到１．７５ ｍｍ以后时，不育株雄蕊逐渐退化，花药逐渐变黄、干瘪；花蕾长度在１．５0～３．０0 ｍｍ时，不育花药的生长速度极为缓慢，该时期是花粉败育的关键时期；徒手压片结果显示，长度为１．５0 ｍｍ的不育花蕾中出现了四分体小孢子解体现象。在进行核不育基因表达分析研究时，花蕾样品分级标准应为蕾长＜１．５0 ｍｍ、１．５0～３．０0 ｍｍ和＞３．０0 ｍｍ ３个等级或者更加细化。

关键词：大白菜；雄性不育；蕾长；小孢子发育

中图分类号：Ｓ６３４．１文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０11）17－3552-04

The Relationship between Bud Length and Microspore Abortion in Male-sterility

Brassica campestris L. ssp. pekinensis

ＪＩ Ｒｕｉ－Ｑｉｎ，ＺＨＯＵ Ｘｕｅ，ＳＯＮＧ Ｑｉａｎ，ＸＩＮ Ｘｉ－ｆｅｎｇ，ＦＥＮＧ Ｈｕｉ

（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ， Ｓｈｅｎｙａｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｓｈｅｎｙａｎｇ １１０１６１， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｕｓｉｎｇ ｇｅｎｉｃ ｍｕｌｔｉｐｌｅ－ａｌｌｅｌｅ ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ ｍａｌｅ－ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ ｉｎ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ Ｌ． ｓｓｐ． pｅｋｉｎｅｎｓｉｓ， ｔｈｅ ｔｗｏ－ｔｙｐｅ ｌｉｎｅ “ＡＢ０１” ａｓ ｍａｔｅｒｉａｌ， ｔｈｅ ｄｙｎａｍｉｃ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｂｕｄ ｌｅｎｇｔｈ ａｎｄ ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｗａｓ ｓｔｕｄｉｅｄ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｓｔａｍｅｎ ｏｆ ｓｔｅｒｉｌｅ ｐｌａｎｔ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｇｒａｄｕａｌｌｙ，ａｓ ｗｅｌｌ ａｓ ｔｈｅ ａｎｔｈｅｒ ｂｅｃａｍｅ ｙｅｌｌｏｗ ａｎｄ ｓｈｒｉｖｅｌｅｄ ａｆｔｅｒ ｔｈｅ ｂｕｄｓ ｌｅｎｇｔｈ ｒｅａｃｈｅｓ １．７５ ｍｍ. Ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｒａｔｅ ｏｆ ｓｔｅｒｉｌｅ ａｎｔｈｅｒ waｓ ｖｅｒｙ ｓｌｏｗ ｉｎ ｔｈｅ ｓｔａｇｅ ｏｆ １．５－３．０ ｍｍ ｂｕｄｓ， ｗｈｉｃｈ waｓ ｔｈｅ ｋｅｙ ｐｅｒｉｏｄ ｏｆ ｐｏｌｌｅｎ ａｂｏｒｔｉｏｎ. Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｆｒｅｅ－ｈａｎｄ ｓｅｃｔｉｏｎｉｎｇ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｔｅｔｒａｄ ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｅ ｗａｓ ｄｉｓｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｉｎ １．５ ｍｍ ｓｔｅｒｉｌｅ ｂｕｄｓ． Ｓｏ ｂｕｄｓ were devided ｉｎｔｏ ｔｈｒｅｅ ｐｒｉｍａｒｙ ｓｔａｇｅｓ， ｓｔａｇｅ Ｉ（ｂｕｄ ｌｅｎｇｔｈ ＜１．５ ｍｍ）； ｓｔａｇｅ ＩＩ （ｂｕｄ ｌｅｎｇｔｈ，１．５－３ ｍｍ） ａｎｄ ｓｔａｇｅ ＩＩＩ （ｂｕｄ ｌｅｎｇｔｈ ＞３ｍｍ） ｏｒ ｏｔｈｅｒ ｍｏｒｅ ｓｔａｇｅｓ ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ｇｅｎｉｃ ｍｕｌｔｉｐｌｅ－ａｌｌｅｌｅ ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ ｍａｌｅ ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ ｉｎ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ Ｌ． ｓｓｐ． pｅｋｉｎｅｎｓｉｓ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｂｒａｓｓｉｃａ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ Ｌ． ｓｓｐ． pｅｋｉｎｅｎｓｉｓ； ｍａｌｅ－ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ； ｂｕｄ ｌｅｎｇｔｈ； ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｅｓ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．

大白菜（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ Ｌ． ｓｓｐ ｐｅｋｉｎｅｎｓｉｓ）为两性花异花传粉蔬菜作物，杂种优势十分显著。由于其花器官小，单花结子少，而单位面积的播种量又较大，雄性不育系的利用是配制大白菜杂交种经济、可靠的制种手段。ＡＢ０１是沈阳农业大学蔬菜遗传育种课题组培育的大白菜核基因雄性不育两用系，已用其配制出４个稳定遗传的雄性不育株系［１］， 并提出了“大白菜核基因雄性不育复等位基因遗传假说”［２］。目前沈阳农业大学蔬菜遗传育种课题组已建立了一套该材料的应用技术体系，并实现了品种间和亚种间不育基因的交流，育成了多个新的具有１００％不育株率的雄性不育系［３，４］，并获得了不育基因Ｍｓ的一些分子标记［５，６］。但是该材料不育的分子机制尚不清楚。

在不育基因时序表达分析研究中，需根据小孢子发育状况把花蕾分成若干等级。孙日飞等［７］的研究认为大白菜核雄性不育系小孢子败育时期是四分体时期，但实际上小孢子的败育在此之前就已经开始。植物的雄性不育特性会使雄性不育植株形态发生变化，特别是与生殖有关的花蕾、花瓣、雄蕊、雌蕊等变化较大，许多研究发现，小孢子的发育时期与花蕾形态指标，如花蕾长、花药长及花瓣长／花药长（瓣药比）密切相关。李丹等［８］表示考虑到花蕾的长度比直径差异大，建议根据花蕾的长度取材。明确复等位遗传的雄性不育大白菜小孢子败育时期与花蕾长度的关系是不育基因时序表达特性分析首先要解决的问题。

１材料与方法

１．１试验材料

沈阳农业大学蔬菜遗传育种课题组选育、稳定遗传的大白菜复等位基因型雄性不育两用系ＡＢ０１，其不育株（ＭｓＭｓ）与可育株（ＭｓｆＭｓ）杂交后代１∶１分离，不育株与可育株育性以外的遗传背景相同，是研究基因差异表达的理想材料。２００８年３月，将两用系ＡＢ０１的种子催芽春化，播种和定植到沈阳农业大学试验基地。在植株现蕾期取不育株和可育株花蕾进行研究。

１．２试验方法

１．２．１花蕊形态学观察方法在解剖镜下取花蕾长度分别为１．５０、１．７５、２．００、２．２５、２．５０、２．７５、３．００、３．２５、３．５０ ｍｍ的不育株与可育株花蕾在ＮＩＫＯＮ生物解剖镜下扒蕾拍照，调查不育株与可育株中花蕊的发育情况。

１．２．２花蕊发育的统计学调查在解剖镜下分别测量不育株与可育株不同长度等级花蕾中的雄蕊、雌蕊、花药的长度。采用随机区组设计，４次重复，每次重复取１０棵植株的花蕾按上述标准进行分级，各等级等量混合组成混样，各测量２０个花蕾，运用ＤＰＳ ７．０５软件进行统计分析。

１．２．３细胞学观察盛花期９∶００～１３∶００从雄性不育两用系ＡＢ０１不育株与可育株中部取始花花序（花序刚开花１～２ ｄ），并分别在同一花序上连续取不同大小的花蕾１０个（根据花蕾形成大小和早晚），然后用卡诺氏固定液固定。用常规压片法于ＮＩＫＯＮ生物显微镜下观察花粉母细胞减数分裂和雄配子体的发育并照相。

２结果与分析

２．１花蕊发育形态学调查

整个花蕾发育过程中，可育株与不育株的雌蕊均呈现稳步增长的趋势，两者之间未见明显差异；而不育株的雄蕊在花蕾发育到后期出现了明显的退化现象，表现为花药颜色发黄、干瘪（图１）。具体表现为：１．５0 ｍｍ时，不育株与可育株中雄蕊发育基本一致，形态学观察未见明显区别；当花蕾长度伸长到１．７５ ｍｍ时，不育与可育花蕾中的花药大小类似，但不育株中花药颜色略为发黄；２．０0～２．５0 ｍｍ时，不育株中花药颜色较可育株中黄，且雄蕊长度明显低于可育株；２．５0～３．０0 ｍｍ时，不育株中花药变得干瘪；３．０0～３．５0 ｍｍ时，不育株中雄蕊出现了萎缩现象，且花药的干瘪程度更加严重。据此将花蕾按照花药在可育不育花蕾中的发育变化情况初步分为６个等级，即１级（花蕾长度＜１．５0 ｍｍ），稳定发育期；２级（花蕾长度１．５0～２.00 ｍｍ），不育初期；３级（花蕾长度２.00～２．５0 ｍｍ）；４级（花蕾长度２．５0～３.00 ｍｍ）；５级（花蕾长度３.00～３．５0 ｍｍ）；６级（花蕾长度＞３．５0 ｍｍ）。

２．２花蕊发育的统计学分析

为了更清楚地调查雌雄蕊在不育株与可育株中的发育差异，在光学显微镜下测量雌蕊、雄蕊及花药的尺寸，并进行统计分析。结果发现，可育花蕾中雌蕊、雄蕊和花药都基本在稳步发育。而不育花蕾中雌蕊的发育与可育花蕾中类似，趋于稳步发展，而雄蕊和花药在不育花蕾中发育非常缓慢，甚至停滞不前。雌蕊生长变化的统计结果发现（表１），在不育和可育株各等级花蕾中雌蕊均呈现显著增长的趋势。可见雄性不育的发生对雌蕊的生长发育影响不大。

雄蕊在可育株与不育株不同长度花蕾中的生长变化统计结果显示（表２），雄蕊在可育株中除３级与４级之间无显著差异外，其他等级之间均呈现显著增长的趋势；而在不育株中，虽然也在不断生长，但生长相对缓慢，表现为每相邻两级之间不呈现显著差异。可见，雄性不育的发生可能与雄蕊发育变化之间有一定的关系。

雄蕊由花丝与花药两部分组成，为了明确雄蕊中影响雄性不育的主要因素，测量了花药的长度并进行统计分析。结果显示（表３），与可育花药相比，不育花药生长速度更为缓慢，表现为在１~２级发育进程中，可育与不育花药都存在显著生长趋势；２~４级进程中，可育花药显著生长，而不育花药生长极为缓慢，后者统计分析中未见显著差异；５级以上时不育花药开始萎蔫缩短，由此可推断花药发育变化是雄性不育发生的主要因素。花蕾在１．５0～３.00 ｍｍ期间是花粉败育的主要时期。

２．３小孢子发育特征

对该材料的小孢子发育进程进行细胞学压片观察。结果显示，不育花药小孢子在四分体时期出现明显的解体现象（图２），而且减数分裂过程非常迅速，表现为同一花药中出现多个时期现象，如可育材料在２.00～２．５0 ｍｍ的部分花蕾中同时出现了减数分裂的中期Ⅰ、后期Ⅰ、中期Ⅱ、后期Ⅱ及四分体时期（图３），而不育材料中同时出现各时期的现象发生在１．５0～２.00 ｍｍ的花蕾中。

３小结与讨论

Ｌａｓｅｒ等［９］认为被子植物雄性不育系花药败育的形式和时期是多种多样的。王福青等［１０］认为雄性败育从小孢子母细胞至二核花粉粒期皆有发生。谢潮添等［１１］在所用的白菜细胞核雄性不育系中发现不育花药的败育发生在小孢子发育过程中。而本研究发现大白菜不育两用系ＡＢ０１不育花药的小孢子在四分体时期出现明显的解体现象，属于上述四分体不能正常发育而败育。已有研究表明向花粉中正常转运营养物质的过程对花粉的发育非常重要。夏涛等［１２］在研究玉米细胞质雄性不育系的物质代谢时提出了“物质亏损”的概念。何凤仙等［１３］在萝卜雄性不育的细胞学初步观察中发现花药发育大多不正常，开花后花药萎缩空瘪瘦小，淡黄色或白色。本研究发现当花蕾发育到２．７５ ｍｍ以上时，花药发生干瘪现象，推测其原因可能是花粉发育到此期间出现明显的营养不足，花粉发育基本停止所致。

为进行大白菜不育两用系ＡＢ０１的分子机制研究提供大量的时序表达基因，进行花蕾与小孢子动态关系研究，提供该材料的分级标准至关重要。王永勤等［１４］在“白菜小孢子发育相关基因ＢｃＭＦ３的分离及序列分析”时，以“矮脚黄”白菜核隐性雄性不育两用系（Ａ/Ｂ Ｌｉｎｅ）的可育株系和不育株系为材料，莲座期取小花蕾、中花蕾和大花蕾（花蕾大小的分级标准是：横径０．５0 ｍｍ以下为小花蕾；横径１．０0～１．５0 ｍｍ 为中花蕾；横径２．５0 ｍｍ以上到开花前为大花蕾）进行研究；Ｓｏｎｇ等［１５］在研究大白菜花粉专一性基因ＢｃＭＦ１１时，根据花粉的发育状况将花蕾按长度分为５个等级（１．０、１．６、２．２、２．８和３．４ ｍｍ）。Ｐａｒｋ等［１６］在研究花粉优先基因ＢＡＮ１０３时，所用材料为分别从１.00~５.00 ｍｍ长花蕾中收集的花药。可见每个学者的分级标准各不相同。本研究发现长度为１．５0 ｍｍ的不育花蕾中就有四分体时期小孢子解体现象发生，暗示着该材料不育产生的早期阶段应该跟踪到１．５0 ｍｍ的花蕾。形态学调查发现，花蕾发育到１．７５ ｍｍ以后时，不育株的雄蕊逐渐出现了明显的退化现象，花药颜色逐渐发黄、干瘪。可见复等位遗传的大白菜雄性不育的发生是一渐变的过程。花蕾长度在１．５0～３．００ ｍｍ时，不育花药的生长速度较可育花药缓慢。由此可推断花蕾在１．５0～３.00 ｍｍ期间是花粉败育的主要时期，在进行复等位基因遗传的核雄性不育分子机制研究时，最基本的分级标准应为：蕾长＜１．５0 ｍｍ；蕾长在１．５0～３．０0 ｍｍ 和蕾长＞３．０0 ｍｍ 3个等级或者更加细化。实践证明，在大白菜核雄性不育复等位遗传的分子机制研究中，通过花蕾和花药的大小及形态特征的观察进行分级，无需制片镜检，即可有效分离育性相关基因，可避免每次取样时需要制片观察确定小孢子败育时期的繁琐程序，具有方便、快捷的特点，为复等位基因遗传的核雄性不育分子机制研究提供了重要的理论依据。

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