辣椒胶孢炭疽菌遗传转化体系的建立

对照，未能扩增出目的条带（图2），说明GFP标记基因已成功转化到辣椒胶孢炭疽病菌的基因组中。

2.2.2 转化菌株的Southern blot验证

采用Southern blot法确认转化菌株的遗传稳定性。试验结果表明，6个转化子均只有一个转基因拷贝（图3）。

2.3 转化子的荧光观察

取培养2～3 d的转化子的菌丝和孢子制成玻片，用激光共聚焦荧光显微镜对获得的25个转化子的荧光信号进行检测，观察发现该25个转化子的菌丝和孢子均发出较强的绿色荧光（图4a，c），说明GFP序列均已成功转入，阳性率达到100%。转化菌株经含500 mg/L的潮霉素B的PDA培养基连续培养3代后，经显微镜观察绿色荧光仍较强（图4e，g），菌丝和分生孢子的生长发育情况没有变化，表明其具有较高的遗传稳定性。

2.4 GFP轉化菌株及野生型菌株的生物学特性差异

2.4.1 GFP转化菌株及野生型菌株的生长情况

采用菌饼法检测菌株生长速率，并利用摇菌法进行产孢量试验。试验结果表明转化菌株与野生型菌株菌落形态及生长速率无明显差异（表1）。转化菌株平均产孢量为0.8×105～1.8×105个/mL，野生型菌株的产孢量为0.8×105～1.4×105个/mL，没有明显差异。

2.4.2 GFP转化菌株的致病性测定

以5×105个/mL 分生孢子接种辣椒果实进行致病性测定，接种6 d后调查致病情况。结果表明，转化菌株及野生型菌株接种的辣椒均出现向内凹陷的病斑，而未接种病原菌的对照未发病（图6）。

3 讨论

PEG-CaCl2介导的原生质体转化方法具有转化效率高、操作简便、体系成熟等特点，在稻瘟病菌、禾谷镰刀菌等丝状真菌遗传转化研究中应用非常成熟[1314]，在杨树、苹果、梨炭疽菌的遗传操作中也有报道，但是在辣椒炭疽病菌中还未报道。胶孢炭疽菌寄主繁多，病菌根据寄主范围而分化为各种类型，各专化型间培养性状、形态及致病力水平存在较大差异。本研究在前期胶孢炭疽菌转化体系的基础上，进一步对辣椒炭疽病菌的转化条件摸索优化，通过PEG-CaCl2介导的原生质体转化方法把含GFP序列的DNA片段转入到辣椒炭疽菌中，并且获得稳定的绿色荧光表达菌株，从而在辣椒炭疽菌中成功建立了高效、稳定的遗传转化体系，为后续研究奠定了基础。

原生质体的制备在辣椒炭疽菌遗传转化的过程中起着关键作用，其质量和数量直接影响转化的效率，而菌株专化型、菌株培养时间等因素均决定着原生质体的质量。辣椒炭疽菌在固体平板及液体培养条件下均易产生分生孢子，当大量分生孢子混杂在原生质体中时，不仅会导致转化效率降低，还会影响转化子的再生。在梨炭疽病菌中，分生孢子在CM液体培养基生长至24 h后，继续转接到新的CM液体培养基中扩培24 h[9]，而本研究缩短了培养时间，新鲜菌丝块置于5×YEG的液体培养基中振荡培养16 h后即用于转化，从而避免了分生孢子对转化过程的影响。

目前，真菌遗传操作过程中的选择标记有潮霉素、博莱霉素、G418等，为真菌的基因转入、敲除提供了多种选择[1516]。本研究在尚不明确辣椒炭疽菌对潮霉素B敏感性的前提下，首先开展了潮霉素B的敏感性测定，经检测发现当潮霉素B浓度为500 mg/L时，能显著抑制辣椒炭疽菌的生长，表明此浓度适合作为遗传转化选择浓度。

本研究所用的转化片段以农杆菌质粒SK1044为模板扩增获得，含有增强型绿色荧光蛋白GFP及来源于异旋孢腔菌的强启动子GPDh，目前SK1044表达载体多在镰刀菌中使用[17]，本研究首次在辣椒炭疽菌中使用了该启动子，获得的转化菌株荧光强度高且较一致，说明GPDh启动子可以在辣椒炭疽菌中高水平启动目的基因的表达。此外，本研究转化过程中使用的是含有T-DNA上下臂、GFP基因及hygR基因的DNA片段，相比转化质粒更加方便且阳性率达到了100%。

在辣椒炭疽病菌遗传转化体系成功建立的同时发现，转化子通过3代培养仍可以表达出明亮绿色荧光，说明GFP基因已整合至转化子基因组中并且能够稳定遗传。同时，考虑到PEG介导的转化方法具有随机插入的特点，我们对获得的转化子进行了Southern blot验证，所选的6个转化子均为单拷贝插入，单拷贝插入比例达到100%。在对其生长和致病过程中的研究发现，尽管转入了外源片段，但是转化子的生物学表型与野生型较为一致，表明转入的GFP片段并不影响辣椒炭疽菌自身的生长发育，因此可用于后续研究辣椒炭疽菌与寄主互作关系。

本研究摸索了辣椒炭疽病菌的原生质体转化条件，建立了高效、稳定的PEG-CaCl2介导的辣椒炭疽病菌遗传转化体系，通过转入绿色荧光表达基因获得带有绿色荧光标记的转化菌株，并且其生长形态、生长速率及致病性与原始菌株没有差异，该结果将为挖掘辣椒炭疽病菌致病相关基因提供强大的技术支持，从而为后续的辣椒炭疽菌与寄主互作的机制研究奠定了良好基础。

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（责任编辑：田 喆）