滇重楼内生真菌分离与多样性研究

学生命科学学院科学研究与人才培养开放基金项目（2012S202）

[通信作者] 申仕康，Tel： （0871） 65031491， E-mail： yunda123456@126.com；王跃华，Tel： （0871） 65031491， E-mail： wangyh58212@126.com

[作者简介] 王茜，硕士研究生，E-mail： wangqianyunda@163.com

滇重楼Paris polyphylla var.yunnanensis （Franch.） Hand.-Mazz.是延龄草科Trilliaceae重楼属Paris多年生草本植物[1]，分布于海拔1 400～3 100 m的常绿阔叶林、云南松、竹林、灌丛、草坡背阴处或阴湿山谷中，为阴生植物。滇重楼作为云南白药、四川白药、宫血宁、夺命丹等一些重要中成药和新药的主要原料之一，已经被收入2000年版《中国药典》[2]。但是，由于该物种自然繁殖率低，生长周期长，导致资源开发与利用上常常出现供不应求的状况，此外，当地居民的滥采滥挖，进一步导致野生资源衰退严重，种群数量稀少。目前，不同学者对该珍贵特有资源植物开展了系统分类[3]、植物化学[4]、繁殖生物学[5]以及遗传多样性[6]等方面的研究工作，这些研究报道为该物种的有效保护和可持续开发利用提供了科学依据。

植物内生真菌（endophyte）是指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物组织或器官内部，但宿主植物不表现出外在病害症状的微生物[7-8]。植物内生真菌具有产生与宿主植物相同或相似药物活性成分的能力[9-10]，从传统药用植物内生真菌代谢产物中寻找活性物质，已经成为植物内生真菌研究的热点问题[11-12]。已有的研究表明，滇重楼与其内生真菌关系密切，滇重楼中的一些内生真菌在体外培养的条件下可以产生甾体皂苷[13]，甾体皂苷是重楼属植物发挥抗肿瘤，抗菌消炎，止血，镇静、镇痛，免疫调节等药理作用的主要活性成分[14-15]。目前对重楼属植物内生真菌的研究主要集中在筛选产甾体皂苷菌株方面[16-17]，而对其内生真菌的分离、鉴定以及多样性等方面的研究则鲜有报道。

鉴于此，本文通过野外采集云南省嵩明、大理和保山3个不同地理种群的滇重楼植株，室内分离不同种群滇重楼根、块茎和叶3个部位的内生真菌，并基于形态学和ITS序列分析对分离获得的内生真菌进行鉴定，探明不同地理种源滇重楼不同部位内生真菌的多样性及其差异性，试验研究不仅对于丰富滇重楼内生真菌菌株多样性与进一步筛选活性菌株具有重要意义，并对揭示该物种与内生真菌的互作关系、探讨其人工繁育等具有重要的理论和实践意义。

1 材料与方法

1.1 滇重楼样品采集

2011年4—5月，采集云南省昆明市嵩明县阿子营乡、大理州鹤庆县松桂镇、保山市隆阳区潞江镇的滇重楼（无病虫害），带土采集后带回温室栽培，留待后续实验。各试验样地的生境条件见表1，试验分别取滇重楼的块茎、根和叶3个部位进行其内生真菌的分离。表1 各样品采集地基本情况

Table 1 Habitat characteristics of samplings in this study

1.2 内生真菌的分离与纯化

参考黄芳等[18]的研究方法，采用PDA培养基（青霉素G钠和硫酸链霉素的质量浓度为120 μg·L^-1）对滇重楼内生真菌进行分离与纯化，其中各部位表面消毒方案为：75%乙醇处理1 min，无菌水冲洗4次，叶片用2.5%次氯酸钠消毒4 min（块茎用0.1%升汞消毒5 min，根用2.5%次氯酸钠消毒15 min），之后用无菌水冲洗5次，无菌滤纸吸干水分待用。接入分离培养基的各组织表面消毒后的处理方法为：叶片剪成0.5 cm×0.5 cm，块茎用解剖刀切成0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm大小的方块，根用解剖刀切成1 cm长小段。菌种保藏采用PDA琼脂斜面培养基，28 ℃恒温箱倒置培养。试验每皿接种5块，各个样地、各个部位各接种20皿。

1.3 内生真菌鉴定

1.3.1 形态鉴定 对分离与纯化获得的内生真菌菌株进行其群体形态特点（包括菌落大小、颜色、表面特征、质地）和个体形态特点（包括菌丝子实体和孢子形态）鉴定，参考《真菌鉴定手册》[19]和《半知菌属图解》[20]对其进行基本的分类，将具有相同形态特征的菌株归并为同一形态类型。

1.3.2 分子鉴定 采用CTBA法[21]提取真菌基因组DNA。 ITS扩增使用的引物为ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）和ITS5（5′-GGAAGGTAAAAGTCAAGG-3′），两者为通用引物，由上海生工生物工程公司合成。50 μL PCR反应体系为：10 μL 10×PCR Buffer，0.25 μL dNTPs（10 mmol·L^-1），1 μL ITS4，1 μL ITS5，0.3 μL Taq酶，1 μL DNA模板，用ddH₂O补足50 μL。扩增程序：94 ℃ 4 min，94 ℃ 1 min，54 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，33个循环，72 ℃ 3 min，4 ℃保存。扩增产物送往上海生工生物工程公司测序。测序结果通过Chromas软件校对，以每个形态型菌株的ITS序列作为靶序列，在NCBI的GenBank数据库中通过Blast搜索，将相似度最高的序列作为参考序列，并用于系统发育分析和鉴定。