双孢蘑菇疣孢霉菌形态特征及防治药剂室内毒力测定

摘要：通过分离、纯化江苏省南京市高淳地区双孢蘑菇疣孢霉菌病菇，对病菌形态特征进行鉴定，同时对该菌株进行药剂毒力测定。结果显示，试验的5种杀菌剂对疣孢霉菌生长均有明显抑制作用，其中50%咪鲜胺锰络合物可湿性粉剂5 g/L的防治效果最显著。

关键词：双孢蘑菇；疣孢霉菌；药剂；毒力测定

中图分类号： S436.46+1文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）06-0110-03

收稿日期：2013-09-04

基金项目：江苏省“青蓝工程”资助项目；江苏农林职业技术学院科研项目（编号：2011KJ14）。

作者简介：谢春芹（1976—），女，江苏沭阳人，硕士，讲师，主要从事食药用菌教学与研究。E-mail：xiechunqin@163.com。双孢蘑菇（Agaricus bisporus）别称白蘑菇、蘑菇、洋蘑菇，是世界性栽培和消费的菇类，我国栽培最多的省份有福建、山东、河南、浙江等[1]；栽培方式有菇房栽培、大棚架式栽培和大棚畦栽等。疣孢霉菌是一种作用于蘑菇、草菇、凤尾菇等粪草腐生食用菌的土壤病原真菌，疣孢霉菌别称蘑菇无头菇病、褐腐病、蘑菇湿泡病，其平均发病率约30%，损失率达30%～40%，高的达90%。目前我国各地应用苯并咪唑类杀菌剂和咪鲜胺锰络合物进行覆土处理，但效果不一[2]，主要是因为各地疣孢霉的不同菌株对同一种药剂的敏感性存在一定的差异。南京市高淳区固城镇是江苏省双孢蘑菇种植最集中、面积最大、总产量最高的基地，近来遭到疣孢霉的严重危害。本试验采集发病菇床的双孢蘑菇，并对病菇有害疣孢霉进行分离鉴定及杀菌剂敏感性试验，筛选出疣孢霉有害菌株的敏感性药剂，为制定双孢蘑菇疣孢霉综合防治措施提供依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1供试药剂种类及来源本试验选用生产上常用的杀菌剂，其种类与来源、试验中所使用的剂量。

1.1.2供试分离疣孢霉菌的病菇本试验采集南京高淳固城镇九龙村双孢蘑菇种植基地的病菇，该基地双孢蘑菇是自然季节棚式栽培，种植的品种为全国生产上大面积栽培的A2796，采集时间为2012年4月，根据病菇子实体的形态变化，采集以下几大类病菇并进行编号。表1供试药剂及其剂量设置

药剂生产厂家剂量设置（mg/L）70%甲基硫菌灵可湿性粉剂浙江威尔达化工有限公司120.0、60.0、30.0、15.0、7.570%代森锰锌可湿性粉剂河北双吉化工有限公司80、40、20、10、550%多菌灵可湿性粉剂江阴市农药二厂有限公司280.0、140.0、70.0、35.0、17.550%咪鲜胺锰络合物可湿性粉剂拜耳作物科学公司50.00、25.00、12.50、6.25、3.13、1.56、0.78400 g/L氟硅唑乳油美国杜邦公司8.0、4.0、2.0、1.0、0.5

表2疣孢霉菌分离的病菇子实体形态特征

样品编号样品外部形态样品内部形态BY1子实体畸形，有霉层，为正常菇的5倍肉质松，菌柄菌盖空心，变色呈半边灰半边黑BY2子实体畸形，有霉层，无菌柄和菌盖，变色微红肉质松如棉花瓤，变色浅咖啡色BY3子实体畸形，有霉层，无菌柄和菌盖，变色灰色肉质松，变色浅咖啡色，稍浅于BY2BY4子实体正常，有霉层，有菌柄和菌盖，子实体小肉质松，变色茶褐色BY5子实体畸形，有霉层，无菌柄和菌盖，子实体小，桃状肉质松，中间有裂痕，变色茶褐色BY6子实体畸形，有霉层，无菌柄和菌盖，枣子状 靠近顶部空心，变色有黑色棱纹BY7子实体畸形，有霉层，顶部有裂痕，变色深红至发暗中间有裂痕，表面针尖大小黄色水滴，变色呈灰暗色BY8子实体畸形，有霉层，有菌柄无菌盖，表面针尖大小黄色水滴 有裂痕，有空洞，变色菌柄和菌盖交接处褐色BY9子实体畸形，有菌柄和菌盖，变色偏灰肉质紧密，变色菌柄和菌盖交接处有黑条纹

1.1.3病菌分离所用的培养基疣孢霉菌的分离采用的是PDA培养基，配方为马铃薯200 g、葡萄糖 20 g、琼脂 20 g、水 1 000 mL，pH值自然，按常规方法配制，分装试管，制作平板培养基[2-5]。

1.2方法

1.2.1病菇中疣孢霉菌的分离与培养一是用消毒好的接种钩摘取病菇表面淡红色霉层；二是用75%乙醇擦拭组织表面，用无菌解剖刀将畸形菇体切开，然后用无菌镊子取病菇内部的少量组织，在无菌条件下接种于PDA平板培养基上，25 ℃ 恒温培养[6]。在PDA培养基上菌落初期白色，随菌龄的增加逐渐变为白色绒状，再转为黄色、黄褐色、褐色、暗褐色。

1.2.2疣孢霉的纯化培养在无菌条件下挑取分离病菇疣孢霉尖端菌丝接种于试管培养基中，25 ℃恒温培养。

1.2.3疣孢霉的形态特征鉴定将分离的疣孢霉各个样品制成临时玻片，在显微镜下观察[3]，结果见图2。由图2可知，疣孢霉的分生孢子有2种：第1种是瓜子仁形或松子仁形，无色，边缘光滑。第2种是双孢结构，葫芦形，大孢褐色、表面网状；小孢无色、光滑，菌丝有柄、无色、管状。双孢结构的分生孢子前期无色，透明，表面光滑，后顶端逐渐膨大，颜色加深，最后下端小孢消失，大孢脱落，深褐色，表面加厚，有不规则突起（龟纹）。

1.3毒力测定与统计方法

1.3.1杀菌剂对疣孢霉的毒力测定将生产上常用的5种杀菌剂稀释成适当的浓度倒入PDA 培养基中制成PDA平板，并设空白对照，将霉菌病原分别接入到制好的5种杀菌剂的平板和空白对照平板中，放在相同条件下培养，定期测定不同杀菌剂下霉菌的生长速度，比较5种杀菌剂分别对霉菌的抑制效果[4-9]。

1.3.1.1杀菌剂平板培养基制作采用PDA 培养基平板抑菌试验[2]。为避免因高温而破坏杀菌剂的药效，待PDA 培养基温度降至50～60 ℃时，将5种杀菌剂稀释成适当浓度，在无菌条件下加入到PDA 培养基的三角瓶中，充分混匀，倒入无菌培养皿中，取15 mL带药培养基倒入直径90 mm的培养皿中，冷却成药液平板培养基。

1.3.1.2接种在无菌条件下，采用打孔接种法（霉菌接种块直径为0.5 cm），每种霉菌接5个平板培养基，并设有空白对照。

1.3.1.3培养与测定放置在25 ℃恒温培养箱中倒置培养，隔2 d测量菌丝生长情况，记录疣孢霉菌菌落生长面积，用自动式游标卡尺测量不同杀菌剂平板中疣孢霉菌菌丝的生长面积，即以疣孢霉菌落的长（cm）和宽（cm）来计算[5-6]。

1.3.2杀菌剂对双孢蘑菇菌丝的毒力测定在进行疣孢霉菌有效药剂与最适防治剂量试验的同时，选取试验中5种杀菌剂对疣孢霉菌菌丝抑制效果最佳剂量，测定其对双孢蘑菇菌丝毒力，方法与杀菌剂对菌盖疣孢霉的毒力测定方法相同。

2结果与分析

2.1杀菌剂对疣孢霉的毒力测定

供试的5种杀菌剂对菌盖疣孢霉菌丝生长均有抑制作用，且不同药剂和同一种药剂的不同剂量对疣孢霉菌的抑制效果均有明显差异。由表3可见，70%代森锰锌 5～80 mg/L对疣孢霉菌生长有抑制作用，且随着剂量的增加，抑制作用增强，尤其是刚接种后2 d，80 mg/L剂量的抑制作用最强，疣孢霉菌菌丝几乎不生长。

不同剂量代森锰锌对疣孢霉菌生长的影响

接种时间

（d）不同剂量下的菌落面积（mm2）CK5 mg/L10 mg/L20 mg/L40 mg/L80 mg/L2221.8120.3193.0933.133.133.141 291.0824.57710.7433.133.133.163 380.62 353.92 274.21 483.3545.433.1

70%甲基硫菌灵7.5～120 mg/L对疣孢霉菌生长有抑制作用，且随着剂量的增加，抑制作用增强。其中，7.5 mg/L剂量的抑制作用最弱，接种后2 d抑制效果不明显；而30 mg/L的剂量对疣孢霉菌抑制效果非常明显，菌丝从刚接种至培养后6 d几乎没有生长。表4不同剂量甲基硫菌灵对疣孢霉菌生长的影响

接种时间

（d）不同剂量下的菌落面积（mm2）CK7.5 mg/L15.0 mg/L30.0 mg/L60.0 mg/L120.0 mg/L2221.8211.598.233.133.133.141 291.01 228.6307.433.133.133.163 380.62 909.033.133.133.133.1

50%咪鲜胺锰络合物0.63～10.00 mg/L对疣孢霉菌生长均有抑制作用，尤其是刚接种后2 d菌丝生长缓慢，几乎没有生长，之后菌丝在低剂量下的生长快于高剂量。剂量5 mg/L以上对疣孢霉菌抑制效果最明显，菌丝从刚接种至培养后6 d几乎没有生长。

50%多菌灵17.5～280.0 mg/L对疣孢霉菌生长均有抑制作用，随着剂量的增加，抑制作用增强。

氟硅唑17.5～280 mg/L对疣孢霉菌生长均表5不同剂量咪鲜胺锰络合物对疣孢霉菌生长的影响

接种时间

（d）不同剂量下的菌落面积（mm2）CK0.63 mg/L1.30 mg/L2.50 mg/L5.00 mg/L10.00 mg/L2221.833.133.1 33.133.133.141 291.0206.2175.0125.933.133.163 380.6384.7321.0268.033.133.1

不同剂量多菌灵对疣孢霉菌生长的影响

接种时间

（d）不同剂量下的菌落面积（mm2）CK17.5 mg/L35.0 mg/L70.0 mg/L140.0 mg/L280.0 mg/L2221.2170.6160.1102.699.998.941 291.91 136.71 234.7840.7694.8584.263 380.43 184.91 946.31 578.71 300.61 294.0

不同剂量氟硅唑对疣孢霉菌生长的影响

接种时间

（d）不同剂量下的菌落面积（mm2）CK17.5 mg/L35.0 mg/L70.0 mg/L140.0 mg/L280.0 mg/L2256.7107.489.7———41 578.9745.2574.5———63 367.51 277.31 184.3———

有抑制作用，随着剂量的增加，抑制作用增强。当氟硅唑剂量在70 mg/L及以上时，疣孢霉菌菌丝不能生长。

2.2杀菌剂对双孢蘑菇菌丝的毒力测定

试验选取5种药剂最适防治剂量（代森锰锌80 mg/L、甲基硫菌灵30 mg/L、咪鲜胺锰络合物5 mg/L、多菌灵280 mg/L和氟硅唑70 mg/L）进行双孢蘑菇菌丝的毒力测定，测定对双孢蘑菇菌丝生长的影响，结果见表8。由表8可见，各杀菌剂对双孢蘑菇菌丝均有一定抑制作用，其中抑制作用最强的是氟硅唑，最弱的是咪鲜胺锰络合物。

不同杀菌剂对双孢蘑菇菌丝生长的影响

药剂菌丝生长速率（mm/d）CK5.17代森锰锌5.09甲基硫菌灵5.13氟硅唑5.01多菌灵5.14咪鲜胺锰络合物5.15

3小結

3.1疣孢霉菌病菌形态特征

本试验分离得到的疣孢霉形态特征及培养特征与文献[3]中的一致。疣孢霉菌广泛分布在土壤中，病源体置于土表2～39 cm处。病残体内的休眠孢子囊能在露地或室内抵抗严寒，顺利越冬。露地越冬位置以在土内3～20 cm致病力最强，过深过浅致病力均显著下降[8]。蘑菇受感染出现病症，需11 d以上的时间。

菇房中疣孢霉菌主要来自覆土，其次是由人、鸟或昆虫传播。当孢子落在生育中的蘑菇附近时才会感染。菌盖和菌柄基部长出白色绒毛状菌丝，进而转变成暗褐色，并流出褐色汁液而腐烂，散发出恶臭。空气潮湿时，会使菌盖和菌柄出现褐色病斑，所以又称为褐腐病。

3.2杀菌剂对疣孢霉的抑制作用和对双孢蘑菇菌丝生长的影响

采用的5种药剂都是市场上常见的杀菌剂，能显著影响有害疣孢霉菌丝生长，涂改临等认为，多菌灵具有广谱性，是多位点杀菌剂，杀菌能力强，对蘑菇低毒、安全、低残留且不易产生抗药性[7，9]。但是本试验结果显示多菌灵效果较差，不能较好地抑制疣孢霉菌丝的生长，这可能是由于近年来多菌灵的使用较普遍，疣孢霉菌对其产生了抗药性。本试验结果表明，50%咪鲜胺锰络合物可湿性粉剂对疣孢霉菌丝抑制效果显著，且对双孢蘑菇菌丝生长影响较小，建议生产上可以使用50%咪鲜胺锰络合物可湿性粉剂作为疣孢霉防治药剂。

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