白芨病菌拮抗菌株的筛选及鉴定

摘要：从白芨根际土壤中筛选出对白芨根腐病有拮抗性的菌株，初步研究其抑菌作用，为白芨病害的生物防治提供参考依据。采用平板稀释法从白芨根际土壤中分离获得菌株，以白芨根腐病菌、白芨灰霉菌、白芨黑斑菌为靶标菌采用平板对峙法筛选出拮抗菌株;分别采用16S rDNA和28S rDNA序列分析方法鉴定拮抗细菌和真菌菌株的分类学地位。结果：共计从白芨栽培土壤中分离到35株细菌和10株真菌菌株，其中8株细菌和6株真菌对4种白芨致病菌表现较好的抑菌活性;经鉴定，细菌菌株大多数为芽孢杆菌，真菌为木霉属，BJ-135为甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus），BJ-175为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），BJ-2为木霉（Trichoderma asperellum）。筛选出的菌株中有5株拮抗菌对4种白芨致病菌均有较好的抑菌活性，菌株BJ-135、BJ-175、BJ-2可用于生防菌剂开发，用于白芨病害防治。

关键词：白芨;根际微生物;致病菌;拮抗菌;抑菌活性

中图分类号： S182  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2019）03-0103-04

白芨[Bletilla striata（Thunb.） Reichb.f.]別称冰球子、地螺丝、利知子、连及草等，为兰科白芨属多年生草本植物[1]，主要分布在我国秦岭以南地域，多生长在潮湿的环境之中，作为我国一种传统的中药材[2]，具有清热利湿、收敛止血、消肿生肌等功效，此外，白芨还是很好的黏合剂和食品增稠剂，白芨应用广泛[2-3]，因此，在市场呈现出供不应求的状态，大量的人工采挖使得野生资源匮乏，于是出现了人工栽培，但在栽培过程中病害不断发生，严重地影响了白芨产业的健康发展。据统计，最常见且危害最严重的真菌性病毒害包括白芨根腐病菌、白芨灰霉菌、白芨黑斑病菌。白芨根腐病主要侵染白芨的根部和叶片，造成根部软化腐烂、叶片褪绿变黄，萎蔫死亡。白芨根腐病致使白芨大面积减产、质量大幅度下降，造成了巨大的经济损失。

目前控制白芨根腐病的主要方法仍以化学杀菌剂为主，但由于化学杀菌剂容易出现抗药性和药物残留，不仅污染环境，还严重地威胁人体健康。随着人们对无公害食品需求的日益增加以及对环境保护的日益关注，生物防治成为了人们控制植物病害的理想途径[4-5]。因此，筛选出生物活性高、抗菌谱广的菌株具有重要的意义。目前国内外对番茄[6]、黄瓜[4，6]等植物生物防治的研究已经取得了较大的进展[4]，但对白芨病害的生物防治还罕有报道。本研究从白芨根际土壤中进行拮抗细菌和真菌的分离筛选，以4种常见的白芨致病菌为供试菌株，对所得菌株进行生理生化及分子生物学鉴定，探讨白芨根际土壤细菌和真菌对不同病原菌的拮抗作用，为解决白芨在栽培过程中的病害问题提供了初步的试验依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供试土样 供试土样采自多年轮作无病害的白芨根际土壤。

1.1.2 培养基 细菌培养采用肉汤（LB）培养基：牛肉膏 3 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、纯净水定容至1 000 mL。固体培养基中加琼脂18.0 g，pH值为7.2。真菌培养采用马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂 15～20 g、自来水1000 mL。

1.1.3 供试菌株 白芨叶褐斑病病菌、叶斑霉病病菌、白芨块茎腐烂病菌、白芨根腐菌均由陕西理工大学微生物实验室保存。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分离纯化 从陕西省汉中市白芨种植区挑选生长状态好的白芨植株，采集其根际土壤，将土壤自然风干后过20目筛，分别称取5 g置于三角瓶中，加入45 mL无菌水及玻璃珠振荡20 min得到土壤样品悬液，依次用无菌水配制成5个浓度梯度的土壤悬液，每个梯度取100 μL均匀涂布在LB培养基表面，每组设置3个重复，于28 ℃下培养3～5 d，挑取性状差异明显的单菌落进行编号，划线法纯化培养，4 ℃保藏备用。拮抗细菌分离采用LB培养基[7-8]，35 ℃培养3～5 d。拮抗木霉菌分离采用PDA培养基[9]，25 ℃培养5～7 d，分离得到的拮抗菌株纯化后，4 ℃保存。

1.2.2 抑菌活性的筛选 本试验以4种白芨致病菌为靶标，采用菌饼法[7，10]筛选拮抗菌株。将预先培养好的白芨致病菌菌饼置于PDA培养基中心，四周距平板边缘1 cm处对称接种拮抗菌株，每种处理3～5次重复，28 ℃培养5～7 d[4，11]。拮抗细菌的筛选采用LB培养基，37 ℃培养2～3 d，看是否有抑菌圈的出现，并记录对照及处理组白芨致病菌菌落直径[2，12]，按公式计算抑制率：

菌丝生长抑制率=（对照菌落直径-处理菌落直径）/（对照菌落直径-菌饼直径）×100%。

1.2.3 抗菌株的鉴定 对初步分离出来的白芨土壤根际细菌采用水煮法进行DNA的提取、16S rRNA分子生物学鉴定[13]，本研究所用引物由康为世纪生物科技有限公司合成，引物序列E-27F：（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）、1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）[14]，应用这2种引物进行PCR扩增，扩增长度大约为1 500 bp[15-16]。扩增体系50 μL，包括：dNTP（4种核苷酸混合物）5 μL、E-27F和1492R 2种引物各2 μL，模板DNA（菌悬液）1 μL，DNA聚合酶0.25 μL，ddH2O补齐。扩增程序为94 ℃预变性2 min;94 ℃ 变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，40次循环;72 ℃终延伸2 min;4 ℃保存，扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测[17]。采用CTAB法用于真菌DNA的提取[18-19]，PCR扩增体系：94 ℃预变性2 min;40个循环（94 ℃ 30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min）;72 ℃延伸2 min，4 ℃保存[20-21]，PCR反应体系为10×Buffer（反应缓冲液）5 μL、脱氧核苷三磷酸底物（dNTP）5 μL，上下游引物ITS1、ITS4各2 μL，DNA模板1 μL、5 U/μL Taq 0.25 μL、ddH2O 34.75 μL，ITS序列长度都在500～750 bp之间[22]。该片段包括ITS1、5.8S rDNA和ITS2的全部序列以及18S rDNA和28S rDNA的部分序列，将完成PCR扩增的样品再次进行1%琼脂糖凝胶电泳[23]，筛选出条带明亮且清晰的样品，将PCR送上海生工生物工程技术服务有限公司测序，测得序列与GenBank数据库进Blast分析，MEGA 6.0软件分析序列同源性，以Neighbor-Joining方法构建系统发育树[24]，Bootstrap（1 000次重复）进行检验。

2 结果与分析

2.1 拮抗菌株分离、纯化结果

从白芨根际土壤中分离得到35株细菌和10株真菌，拮抗菌株筛选研究发现，对白芨致病菌有抑菌活性的菌株共计14株（表1、表2）。其中，对白芨根腐菌有抑菌作用的菌株有14株，占拮抗菌总株数的100%;对白芨叶斑霉病病菌、白芨叶褐斑病病菌、块茎腐烂病菌有抑菌作用的菌株9株，占拮抗菌总株数的64.29%。在上述14株具有抑菌效果的微生物菌株中，BJ-169、BJ-017、BJ-135、BJ-002、BJ1-07、BJ2-04对4种供试致病菌均有较好的抑菌活性。

2.2 拮抗菌株鉴定

8株拮抗细菌同源性分析结果（图1）表明，菌株BJ-169芽孢杆菌Bacillus sp.（KX360745）的序列同源性高达100%，它们位于系统发育树同一分支上;综合同源性比对结果，BJ-135属甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）;BJ-175为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）;菌株BJ-179与梭形芽孢杆菌Lsinibacillus sp.（MF784470）的序列同源性达100%;BJ-7属于嗜气杆菌属Sporosarcina sp.（KY465523）;BJ-70燕麦属Acidovorax sp.（KF999729）;菌株BJ-2与假单胞菌属Pseudomonas sp.（KJ642347）;6株拮抗真菌综合同源性比对结果（图2），BJ2-4、BJ2-6与Aspergillus udagawae（LC317462）的同源性100%，它们位于系统发育树的同一分支上，综合同源性比对结果和BJ2-4、BJ2-6与曲霉在发育系统中的位置，该菌株应属于曲霉;BJ2-9与Trichoderma asperellum（MF808619）的序列同源性达到100%，它们位于系统发育树的同一分支上，综合同源性比对结果和在发育系统中的位置，该菌株应属于剌孢木霉;菌株BJ2-3与Aspergillus tubingensis（MG647866）序列同源性达100%，综合同源性比对结果和BJ2-3在发育系统中的位置，该菌应属于Aspergillus tubingensis;菌株BJ1-7与Penicillium oxalicum（MG543697）序列同源性达100%，综合同源性比对结果和BJ1-7在发育系统中的位置，该菌应属于Penicillium oxalicum;菌株BJ1-2与Trichoderma effusum（MF040213、MF136544）序列同源性达100%，综合同源性比对结果和BJ1-2在发育系统中的位置，该菌株属木霉属。

3 讨论

从白芨根际土壤中分离得到35株细菌和10株真菌，其中对白芨致病菌有抑菌活性的菌株共计14株，这些菌株对白芨根腐病菌、白芨灰霉菌、白芨黑斑病菌以及白芨块茎腐烂病菌都有不同程度的抑制作用，其中6种菌株对供试菌株都有拮抗作用，且抗菌活性较强。分别采用细菌16S rRNA和真菌18S基因序列对分离出的细菌和真菌进行分子生物学鉴定[11]，发现这些细菌主要分布在芽孢杆菌属中、真菌主要分布在木霉属中，甲基营养型芽孢杆菌是2011年才被鉴定的新种，刘利强等利用该菌种防治黄瓜灰霉病[8]。枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌作为芽孢杆菌属的重要成员[25]，在防治传统农业产品病害的同时，也逐渐用于人参病害生物防治。据已有的报道显示，枯草芽孢杆菌广泛应用于植物根部[26]、枝干[27]、叶[28]、花部以及果蔬采摘后病害的防治方面，甚至用于人和动物疾病的治疗和预防。因此，本研究首次从白芨根际土壤中分离得到的这2种芽孢杆菌可能与枯草芽孢杆菌[29]在一些生理活性上具有密切关联性，比如它们的抑菌活性。除此之外，本研究中分离得到的芽孢杆菌属中存在大量抑制白芨根腐病菌、叶斑霉病病菌、白芨叶褐斑病病菌以及白芨塊茎腐烂病菌的活性菌。目前，普遍的观点认为芽孢杆菌主要通过营养和空间位点竞争、抗菌物质产生、溶菌作用、诱导植物抗病性等方面来发挥其防病促生作用[30-31]。正是通过这些相关机制，芽孢杆菌杀菌剂对多种植物病原菌产生较强的拮抗作用，并同时具备环境兼容性好、抗逆性强、对人畜安全、不易产生抗药性等优点[29]。因此，利用所获得的具有抗菌活性的芽孢杆菌进行深入研究、开发相关微生物菌剂是后续要进行的重要工作之一。自发现木霉菌对植物病原真菌有拮抗作用以来，科学家们从诸多方面开展了木霉菌的生防研究。由于木霉菌的拮抗作用具有广谱性，目前已被认为是用于植物病害生物防治最有潜力的生防菌之一。据已有研究报道，木霉对人参锈腐菌等引发的人参根部病害有较好的防治效果。丁万隆等研究发现，木霉菌剂可显著降低西洋参立枯病的发病率[13]。本试验结果表明，白芨根际病原菌受到木霉菌抑制后有明显的生长停滞甚至萎缩现象，据已知木霉菌生防机制，推测可能是木霉菌生长速度快，对病原菌形成营养和空间的双重竞争，使病原菌因缺乏营养和空间而萎缩;另外也可能是木霉对病菌菌丝的重寄生作用，导致病菌菌丝生长受到抑制。本试验筛选出的14株拮抗菌对4种白芨致病菌均有较强的抑菌活性，证明其在白芨病害生物防治领域有较大的应用潜力。后续将深入探索上述菌株对白芨致病菌的抑菌作用机制，结合田间病害防效测定，为白芨病害生物防治提供科学依据。

参考文献：

[1]王跃华，陈燕，刘 曼，等. 培育优质白及苗条件筛选研究[J]. 江苏农业科学，2018，46（20）：165-167.

[2]万大群，赵仁全，刘 海，等. 白及的成分、药理作用和临床应用研究进展[J]. 中国药业，2017，26（2）：93-96.

[3]He X R，Wang X X，Fang J C，et al. Bletilla striata：medicinal uses，phytochemistry and pharmacological activities[J]. Journal of Ethnopharmacology，2017，195（2）：20-38.

[4]陈颖潇，何 胥，施洁君，等. 黄瓜霜霉病生防菌株的筛选及防病促生研究[J]. 安徽农业科学，2015，43（23）：121-124.

[5]李天来，杨丽娟. 作物连作障碍的克服——难解的问题[J]. 中国农业科学，2016，49（5）：916-918.

[6]范志航，李 波，于侦云，等. 微生物肥“宁盾”对番茄青枯病的生防效果[J]. 安徽农业科学，2015，43（24）：87-88，121

[7]李 勇，赵东岳，丁万隆，等. 人参内生细菌的分离及生防菌株的筛选[J]. 中国中药杂志，2012，37（11）：1532-1535.

[8]刘利强，杨士玲，陈 强，等. 30亿个/g甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂防治黄瓜灰霉病田间药效试验[J]. 现代农业科技，2014（9）：130-133.

[9]刘兆迪，解修超，陈文强，等. 药用植物三尖杉内生真菌的分离鉴定及抗菌活性[J]. 中国实验方剂学杂志，2014，20（9）：128-132.

[10]王瑞飞，康春晓，许圆圆，等. 怀地黄内生细菌的分离鉴定及抗菌活性[J]. 江苏农业科学，2017，45（13）：82-86.

[11]梁 勤，乔登嫣，马小明，等. 甘肃道地中药大黄、黄芩对多重耐药菌的抑菌活性[J]. 西部中医药，2014，27（5）：5-7.

[12]邹庆甲，王树桐，梁魁景，等. 河北省苹果园根际土壤中疑似致病镰孢菌种类[J]. 菌物学报，2014，33（5）：976-983.

[13]丁万隆，程惠珍，陈 君. 应用木霉制剂防治几种药用植物病害的研究[J]. 中国中药杂志，2003，28（1）：28-31.

[14]王 超，郭坚华，席运官，等. 拮抗细菌在植物病害生物防治中应用的研究进展[J]. 江苏农业科学，2017，45（18）：1-6.

[15]National Institute of Allergy and Infectious Diseases （US）. NIAID global health research plan for HIV/AIDS，malaria，and tuberculosis[M]. National Institute of Allergy and Infectious Diseases，National Institutes of Health，US Department of Health and Human Services，2001.

[16]Jiang C M，Shi J L，Liu Y L，et al. Inhibition of Aspergillus carbonarius and fungal contamination in table grapes using Bacillus subtilis[J]. Food Control，2014，35（1）：41-48.

[17]Chen D，Liu X，Li C，et al. Isolation of Bacillus amyloliquefaciens S20 and its application in control of eggplant bacterial wilt[J]. Journal of Environmental Management，2014，137（4）：120-127.

[18]贾 斌，赵贞丽，沈国娟，等. 人参黑斑病生防用内生拮抗菌分离鉴定及发酵浓缩液的性质[J]. 中国森林病虫，2014，33（3）：5-10.

[19]张德珍，李鹏昌，陈晓霞，等. 山东省小麦根腐病病原菌的分离鉴定[J]. 植物保护学报，2016，43（2）：233-240.

[20]陈天祥，孙 权，顾 欣，等. 设施蔬菜连作障碍及调控措施研究进展[J]. 北方园艺，2016，40（10）：193-197.

[21]Xiang Z Y，Zhang L，Zhang Q F. Soil nutrients and microbial functional diversity of different stand types in Qinghai Province[J]. Scientia Silvae Sinicae，2014，50（4）：22-31.

[22]魏 崍，王伟威，李馨园，等. 大豆抗腐霉根腐病的生理差异研究[J]. 大豆科学，2017，36（3）：425-429.

[23]Mann J. Natural products as immunosuppressive agents[J]. Natural Product Reports，2001，18（4）：417-430.

[24]翁远超，刘静雯，崔 璨，等. 秦皮中化学成分的分离鉴定及其体外抑菌活性[J]. 中国药物化学杂志，2014（1）：40-47.

[25]彭 震，王春娟，陈庆河，等. 生物肥料“宁盾”对大豆疫霉病的防效及对毛豆的促生作用[J]. 上海农业学报，2014，30（6）：95-98.

[26]刘 琴，刘 翼，何月秋，等. 我国植物病害生物防治综述[J]. 安徽农学通报，2012，18（7）：67-69.

[27]王 琴，高 青，缪卫国，等. 3种生防细菌2种药剂剂型对芒果炭疽病菌的拮抗作用初探[J]. 广东农业科学，2014，41（11）：82-88.

[28]郎多勇，张文晋，解植彩，等. 宁夏产甘草内生细菌分离纯化、拮抗植物病原菌菌株的筛选及鉴定[J]. 时珍国医国药，2017（9）：184-186.

[29]陈志谊. 芽孢杆菌类生物杀菌剂的研发与应用[J]. 中国生物防治学报，2015，31（5）：723-732.

[30]吴林坤，林向民，林文雄. 根系分泌物介导下植物-土壤-微生物互作关系研究进展与展望[J]. 植物生态学报，2014，38（3）：298-310.

[31]周文杰，吕德国，秦嗣军. 植物与根际微生物相互作用关系研究进展[J]. 吉林农业大学学报，2016，38（3）：253-260.