稻蝗肠道真菌的除草活性筛选及菌株DH03的鉴定

摘要利用涂布平板法从中华稻蝗肠道中分离得到6株真菌，活性筛选试验表明菌株DH03具有较好的除草活性。当供试质量浓度为100 μg/mL时，该菌株发酵液的乙酸乙酯提取物对稗草和反枝苋根生长的抑制率均大于80%，比阳性对照2,4二氯苯氧乙酸的活性好；进一步研究表明发酵液活性物质主要集中在中等极性部分；该菌株的发酵液对盆栽稗草幼苗生长表现出较强的抑制作用，当喷施发酵液原液时，稗草的受害率和均株高分别为36.1%和9.78 cm。经形态学观察和ITS序列分析确定该菌株为Cladosporium oxysporum。DH03作为微生物源除草剂值得进一步研究。

关键词中华稻蝗；昆虫肠道真菌；除草活性

中图分类号:S 476文献标识码：ADOI：10.3969/j.issn.05291542.2014.03.013Screening of herbicidal fungi from the gut of Oxya chinensis

and identification of the strain DH03Lan Tian,Chen Tingting,Shao Mingwei,Fan Qiuqin,Pan Qianqian,Wen Dan,Zhang Yinglao(College of Chemistry and Life Sciences, Zhejiang Normal University， Jinhua321004, China)AbstractSix fungi were isolated from the gut of Oxya chinensis by plate separation method. The phytotoxic experiments suggested that the strain DH03 had the best herbicidal activity. When the mass concentration was 100 μg/mL, the inhibition rates of EtOAc extract against the roots of Echinochloa crusgalli and Amaranthus retroflexus were more than 80%, comparable to that of 2,4dichlorophenoxyacetic acid. Further research showed that the main herbicidal ingredients of fermentation broth were in the moderate polar part. Moreover, its fermentation broth showed a strong inhibitory effect on growth of E. crusgalli. Sprayed with fermentation broth of DH03, victimization rate and average plant height were 36.1% and 9.78 cm, respectively. The strain was identified as Cladosporium oxysporum by the morphological features and ITS sequence analysis. As a microbial herbicide, it is worthy of further study.

Key wordsOxya chinensis;insect gut fungus;herbicidal activity 稗草［Echinochloa crusgalli (Linn.) Beauv.］和反枝苋［Amaranthus retroflexus Linn.］为世界性分布的恶性杂草，严重危害农业生产［12］。长期使用化学除草剂进行防除带来了环境污染严重和杂草抗药性增强等诸多问题［34］，而生物源除草剂以资源丰富、毒性小、残留少、选择性强、环境兼容性好、经济效益高等优于化学除草剂的特点，逐步引起人们的重视［5］，其中微生物或微生物代谢产物作为除草剂具有许多潜在优势［6］，已成为一个研究重点。目前，微生物源除草剂的研究主要集中在土壤放线菌和植物病原菌两个方面［7］，但对于昆虫肠道菌研究的报道却很少。研究表明昆虫肠道菌能分泌一些消化酶帮助昆虫消化［89］，还可能合成植物毒素，杀死植物以利于昆虫消化［10］。因此，昆虫肠道菌作为一种研究较少的特境微生物资源［11］，可能是新型天然除草剂的一个重要来源。在较系统研究棉蝗和负蝗肠道真菌除草活性的基础上［10,1213］，活性筛选表明一株稻蝗肠道真菌DH03具有较强的除草活性。本文报道该活性菌株并初步确定其分类地位，旨在为开发新型微生物源除草剂奠定基础。

1材料

1.1样品采集

供试昆虫中华稻蝗［Oxya chinensis (Thunb.)］采自浙江师范大学校园内。

1.2供试杂草种子

供试杂草种子为常见杂草稗草(Echinochloa crusgalli)和反枝苋(Amaranthus retroflexus)的种子。

1.3培养基

MEA培养基：生麦芽20 g，加水煮沸30 min，经纱布过滤，滤液加水补足至1 000 mL，加入15~20 g琼脂，加热溶化，再加蔗糖20 g和蛋白胨1 g，分装，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。

ME培养基：MEA培养基相应的液体培养基，不加琼脂。

2方法

2.1菌种的分离和纯化

参照文献的方法［12］，将捕捉到的中华稻蝗饥饿24 h后，在无菌条件下解剖，分离出的肠道用75%乙醇表面消毒2 min，无菌水漂洗3次，加少量无菌水在无菌研钵中研磨，用无菌水将研磨液梯度稀释成10-1、10-2，分别取0.2 mL稀释液涂布于MEA培养基平板上，28 ℃恒温培养，待菌体长出后，挑取菌落边缘菌丝纯化，得到6株稻蝗肠道真菌。

40卷第3期蓝添等：稻蝗肠道真菌的除草活性筛选及菌株DH03的鉴定20142.2菌种的发酵及产物的提取

挑取新鲜的菌丝体接种到ME培养基中，于摇床上180 r/min 30 ℃培养7 d。发酵液在室温下过滤，所得滤液用乙酸乙酯萃取2~3次，至萃取液变为无色，经减压浓缩得到粗浸膏。

2.3菌株DH03发酵液不同极性物质的提取

菌株DH03的发酵滤液依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取2~3次，至萃取液变为无色，经减压浓缩后分别得石油醚提取物、乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物。

2.4除草活性测试

除草活性测试采用培养皿生物分析法［10］，分别测定各提取物对稗草和反枝苋的除草活性。将杂草种子置于28 ℃下催芽1~2 d，待种子露白后备用。将待测物质用丙酮溶解，配制成100 μg/mL的药液。在直径为9 cm的培养皿中放入一张圆滤纸片，加入待测药液5.00 mL，待溶剂挥发干后，加入5.00 mL蒸馏水，选择15粒成熟度一致的露白的种子放入培养皿中，盖好皿盖，置于28 ℃智能光照培养箱中培养，处理1~3 d后测定根长。另外设丙酮和相同浓度的2,4二氯苯氧乙酸(2,4D)分别作为空白对照和阳性对照。按如下公式计算抑制率：抑制率（%）=［(空白对照组的根长-处理组的根长)/(空白对照组的根长)］×100。

2.5DH03发酵液对盆栽稗草幼苗的生长抑制活性测定将催芽后的稗草种子播种于直径为10 cm的花盆中，每盆10株，置于28 ℃智能光照培养箱中培养，出苗后第3天分别喷施发酵原液和用蒸馏水稀释10、20倍的发酵液，13 d后观察幼苗受害程度，测量株高。另设蒸馏水和100 μg/mL的2,4D溶液分别作为空白对照和阳性对照。幼苗受害级别观察与受害率计算的方法参照文献［14］，受害率(%)=∑［(每盆各受害级别株数×级别)/(每盆株数×最高级别)］×100。

2.6DH03菌种鉴定

将该菌接种于MEA平板上，培养7 d后观察菌落的表面状态、颜色等特征。挑取少量菌落制片，利用显微镜观察菌丝形态和产孢结构等。同时用基因组DNA提取试剂盒提取菌株的基因组DNA，采用ITS5.8S rDNA区域的通用引物ITS1(5′TCCGTAGGTGAACCTGCGG3′)和ITS4(5′TCCTCCGCTTATTGATATGC3′）对ITS基因进行PCR扩增。产物经检测、纯化后由上海生工生物工程有限公司测序。将获得序列进行BLAST比对，构建系统发育树，确定菌株的分类地位。

2.7数据分析

采用SPSS软件对数据进行差异显著性分析（Duncan多重比较分析,P=0.05）。

3结果与分析

3.16株稻蝗肠道真菌提取物对稗草和反枝苋根生长的抑制作用6株稻蝗肠道真菌提取物对稗草和反枝苋根生长的抑制作用结果见表1。供试质量浓度均为100 μg/mL时，6株真菌发酵液的乙酸乙酯提取物对常见杂草稗草和反枝苋根的生长均表现出一定的抑制作用。菌株DH03的除草活性最强，其对稗草根的抑制率为96.9%，与阳性对照2,4D活性（97.2%）相当；其对反枝苋根的抑制率为80.8%，高于阳性对照活性（74.2%）。菌株DH04的活性次之，其对稗草和反枝苋根生长的抑制率分别为49.7%和65.2%。表16株真菌发酵液乙酸乙酯粗提物对稗草和反枝苋根生长的抑制作用1)

Table 1Inhibitory effects of EtOAc extracts from the fermentation broth of six fungi

against the roots of E. crusgalli and A.retroflexus处理

Treatment稗草 E. crusgalli根长/mmRoot length抑制率/%Inhibition rate反枝苋 A. retroflexus根长/mmRoot length抑制率/%Inhibition rateDH01(20.2±0.3)c(19.3±1.1)d(4.3±0.1)d(51.4±0.7)dDH02(14.3±0.5)d(42.9±2.0)c(5.8±0.1)c(35.0±1.3)eDH03(0.8±0.1)f(96.9±0.4)a(1.7±0.1)g(80.8±1.8)aDH04(12.6±0.4)e(49.7±1.3)b(3.1±0.2)e(65.2±2.2)cDH05(21.3±0.2)b(15.0±1.2)e(8.3±0.2)b(6.7±2.9)fDH06(20.7±0.6)bc(17.2±2.4)de(8.7±0.1)a(2.2±1.4)g2,4D(0.7±0.0)f(97.2±0.0)a(2.3±0.1)f(74.2±1.2)bCK(25.0±0.2)a(8.9±0.1)a

1) 所有提取物质的质量浓度均为100 μg/mL；2,4D为阳性对照，CK为空白对照；表中所列数据为3次重复的平均值±标准差；同一列不同字母表示差异显著（P<0.05）。

The mass concentration of EtOAc extracts was 100 μg/mL; 2,4D: positive control, CK: negative control; the data in the table are mean ± standard deviation for triplicate experiments; different letters in the same column indicate significant difference（P<0.05）.

3.2DH03发酵液不同极性提取物对稗草和反枝苋根生长的抑制作用DH03发酵产物不同极性提取物对稗草和反枝苋根生长的抑制作用结果见表2。DH03发酵液的3种提取物中，乙酸乙酯提取物对稗草和反枝苋根生长的抑制作用最强，抑制率分别为66.5%和47.0%；正丁醇提取物对稗草根的抑制作用强于石油醚提取物，而它们对反枝苋根生长的抑制活性相当。上述结果表明DH03发酵液除草活性成分主要集中在中等极性部分。

表2DH03发酵液不同极性提取物对稗草和反枝苋根生长的抑制作用1)

Table 2Inhibitory effects of different polar fractions from DH03 fermentation broth

against the roots of E. crusgalli and A.retroflexus提取物Extract稗草 E. crusgalli根长/mmRoot length抑制率/%Inhibition rate反枝苋 A. retroflexus根长/mmRoot length抑制率/%Inhibition rate石油醚提取物

Petroleum ether extract(8.6±0.1)b(33.5±0.4)d(4.0±0.1)b(33.2±3.0)c乙酸乙酯提取物

EtOAc extract(4.4±0.1)d(66.5±0.8)b(3.2±0.1)c(47.0±2.3)b正丁醇提取物

Nbutanol extract(6.8±0.1)c(47.9±1.4)c(4.2±0.1)b(30.2±0.9)c2,4D(2.0±0.0)e(84.2±0.3)a(1.5±0.1)d(75.4±2.2)aCK(13.0±0.2)a(6.0±0.2)a

1) 所有提取物质的质量浓度均为100 μg/mL；2,4D为阳性对照，CK为空白对照；表中所列数据为3次重复的平均值±标准差；同一列不同字母表示差异显著（P<0.05）。

The mass concentration of extracts was 100 μg/mL; 2,4D: positive control, CK: negative control; the data in the table are mean±standard deviation for triplicate experiments; different letters in the same column indicate significant difference（P<0.05）.

3.3DH03发酵液对盆栽稗草幼苗生长的抑制作用

DH03发酵液对盆栽稗草幼苗生长的抑制作用结果见表3。DH03发酵液对盆栽稗草幼苗表现出较强的抑制作用，且随着发酵液浓度的提高，抑制作用逐渐增强。当喷施发酵原液时，稗草受害率和平均株高分别为36.1%和9.78 cm，其抑制活性比阳性对照2,4D稍弱。

3.4DH03菌种鉴定

在MEA培养基上，菌丝初为无色，数天后菌落呈灰褐色，中部凸起，呈绒毛状，菌丝疏松。分生孢子梗直或微弯，不分支，有隔，褐色，有明显的节状膨大；分生孢子顶生于梗顶膨大体上，呈圆柱形、椭圆形或近球形，深褐色。以上形态特征与文献［15］中基本一致，初步确定DH03为枝孢属真菌。其ITS基因扩增产物序列长度为570 bp，经BLAST比对，与枝孢属Cladosporium oxysporum（登录号：JN887339）的相似性达99%以上，亲缘关系最近，在系统发育树上处于同一分支（图1）。结合形态学特征，将菌株DH03鉴定为C. oxysporum。

图1基于5.8S rDNA基因序列构建的菌株DH03与枝孢属相关菌株之间的系统发育树

Fig.1Phylogenetic tree based on 5.8S rDNA gene sequences of DH03 and related strains

表3DH03发酵液对盆栽稗草幼苗生长的抑制作用1)

Table 3Inhibition effects of DH03 fermentation

broth against the growth of E. crusgalli处理

Treatment受害率/%

Victimization rate株高/cm

Plant height0(36.1±3.5)b(9.78±2.09)b稀释倍数

Dilution ratio10(30.6±4.2)c(10.68±2.48)b20(22.8±2.5)d(11.06±0.84)ab2,4D(54.4±1.0)a(5.24±0.46)cCK(13.3±2.9)e(14.46±2.48)a

1) 2,4D为阳性对照，CK为空白对照。表中所列数据为3次重复的平均值±标准差；同一列不同字母表示差异显著（P<0.05）。

2,4D: Positive control； CK： Blank control； The data in the table are mean ± standard deviation for triplicate experiments; different letters in the same column indicate significant difference（P<0.05）.4讨论

本研究从中华稻蝗肠道中分离出6株真菌，并从中筛选出1株对稗草和反枝苋幼根具有较强抑制活性的真菌C. oxysporum DH03，经测定，其除草活性物质主要集中在中等极性部分，且其发酵液对稗草幼苗具有较好的抑制活性。因此，稻蝗肠道菌C. oxysporum DH03具有开发成微生物源除草剂的潜力，值得深入研究。

昆虫是地球生物圈中已知种类最多的一类生物，昆虫的种类、数量及分布范围的多样性意味着昆虫肠道菌的多样性［16］，我们的研究及Gebhardt等发现昆虫肠道菌具有除草活性［1213,17］，因此，昆虫肠道菌可能是新型天然除草剂的广泛来源。但是令人遗憾的是，目前对于昆虫共生菌次生代谢研究仅有极少报道，亟待研究开发。

参考文献

［1］李海波,侯守贵,代贵金,等. 水稻和稗草种间竞争关系研究现状［J］. 中国农学通报, 2011,27(15):259262.

［2］马小艳,马艳,奚建平,等. 反枝苋种子休眠解除方法研究［J］. 杂草科学, 2011,29(2):2325.

［3］Petroski R J, Stanley D W. Natural compounds for pest and weed control［J］. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2009,57:81718179.

［4］张朝贤,倪汉文,魏守辉,等. 杂草抗药性研究进展［J］. 中国农业科学, 2009,42(4):12741289.

［5］孙巍,张蕾,吴迪,等. 微生物除草剂的研究进展与展望［J］. 微生物学杂志, 2006,26(2):8891.

［6］仉欢,王开运. 微生物除草剂研究进展［J］. 杂草科学, 2010(2):17.

［7］徐文平,陶黎明. 以微生物代谢物进行除草剂开发的研究进展［J］. 现代农药, 2011,10(4):18,19.

［8］Lundgren J G, Lehman R M. Bacterial gut symbionts contribute to seed digestion in an omnivorous beetle［J］. PloS One, 2010,5(5): e10831.110.

［9］Vistto L E, Oliveira M G, Guedes R N, et al. Contribution of gut bacteria to digestion and development of the velvetbean caterpillar, Anticarsia gemmatalis［J］. Journal of Insect Physiology, 2009,55:185191.

［10］张应烙,尹彩萍,叶圣涛,等. 棉蝗肠道真菌Phoma sp.HC03除草和免疫抑制成分研究［J］. 天然产物研究与开发, 2010,22(4):600602.

［11］Larsen T O, Smedsgaard J, Nielsen K F, et al. Phenotypic taxonomy and metabolite profiling in microbial drug discovery［J］. Natural Product Reports， 2005,22：672695.

［12］Zhang Y L, Ge H M, Li F， et al. New phytotoxic metabolites from Pestalotiopsis sp.HC02, a fungus residing in Chondracris rosee gut［J］. Chemistry & Biodiversity, 2008,5:24022407.

［13］Zhang Y L, Kong L C, Jiang D H, et al. Phytotoxic and antifungal metabolites from Curvularia sp.FH01 isolated from the gut of Atractomorpha sinensis［J］. Bioresource Technology, 2011,102(3):35753577.

［14］褚秋华, 朱云枝, 强胜. 苯噻酰草胺苄嘧磺隆室内配方筛选试验［J］. 杂草科学, 2002(4):1517.

［15］李天飞,张中义. 枝孢属Cladosporium分类研究［J］. 云南农业大学学报, 1992,7(2):6370.

［16］张应烙. 昆虫肠道真菌的新活性物质研究［D］. 南京:南京大学, 2008.

［17］Gebhardt K, Schimana J, Müller J, et al. Screening for biologically active metabolites with endosymbiotic bacilli isolated from arthropods［J］. FEMS Microbiology Letters, 2002,217:199205.