DAPK基因启动子区过甲基化与颈段食管癌的关系

【摘要】目的 探讨死亡相关蛋白激酶基因启动子区过甲基化与颈段食管癌的关系。方法 采用甲基化特异性PCR（MSP）法和逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法分析颈段食管部正常黏膜、颈段食管癌及相应癌旁组织中DAPK基因启动子区过甲基化及其mRNA表达状况。结果 42例颈段食管癌组织中，有27例(64.3%)DAPK基因启动子区过甲基化，其在各病理分级和T分级之间差异无统计学意义（P>0.05），而在N分级之间差异有统计学意义（P<0.05）。25例癌旁组织中，有6例过甲基化，且均为颈段食管癌组织中有过甲基化的病例。颈段食管部正常组织、非甲基化的颈段食管癌组织和癌旁组织中均有DAPK mRNA表达。结论 颈段食管癌中DAPK基因启动子区过甲基化与mRNA失表达有关，可能是颈段食管癌发生、发展的原因之一。

【关键词】颈段食管肿瘤；蛋白激酶类/遗传学；基因表达；DNA甲基化

死亡相关蛋白激酶（death-associated protein kinase，DAPK）是一种钙离子和钙调素依赖的丝氨酸和苏氨酸蛋白激酶，它参与干扰素-γ、肿瘤坏死因子-α、Fas等诱导的细胞凋亡过程，具有促进凋亡的功能［1］。DAPK的正常表达可抑制肿瘤的发生、发展和转移。有研究发现，在一些恶性细胞株或肿瘤组织中，DAPK表达缺失或极少表达，可能与其基因启动子区CpG岛过甲基化有关。为探讨抑癌基因DAPK启动子区CpG岛过甲基化与颈段食管癌的关系，笔者观察了颈段食管部正常组织、颈段食管癌及相应癌旁组织中DAPK基因启动子区过甲基化及其mRNA表达情况。

1 资料与方法

1.1 一般资料 42例颈段食管癌及相应癌旁组织来源于笔者所在医院手术切除的标本，25例癌旁组织取自肿瘤边缘5 mm外区域，为肉眼下正常组织，且病理检查未见癌细胞浸润。5例颈段食管部正常组织来自颈段食管外伤手术修复的患者。颈段食管部组织切除后，立即放入－70 ℃冰箱中备用。42例颈段食管癌患者中，男34例，女8例。年龄最小者32岁，最大者78岁，平均53.4岁。术前均未经化疗或放疗。全部颈段食管癌组织经病理诊断均为鳞状细胞癌，其中高分化17例，中分化10例，低分化15例。按1997年国际抗癌协会TNM标准，T1期7例，T2期9例，T3期15例，T4期11例，N0期29例，N1期13例。

1.2 主要试剂及仪器 基因组DNA修饰试剂盒购于美国Intergen公司；TRIzol试剂购于GIBCO公司；逆转录酶MLV为Promega公司产品。PCR仪为9600型，成像系统为Grab-it 4.0，分析软件为Gelworks 1 D interdiate。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取和亚硫酸氢钠修饰 DNA提取用酚氯仿抽提法。取1 μg DNA，用基因组DNA修饰试剂进行修饰。

1.3.2 甲基化特异性PCR DAPK基因的扩增用甲基化特异性PCR（MSP）法。甲基化引物：5-GGA TAG TCG GAT CGA GTT AAC GTC-3 (上游)，5-CCC TCC CAA ACG CCG-3（下游）；非甲基化引物：5-GGA GGA TAG TTG GAT TGA GTT AAT GTT-3（上游），5-CAA ATC CCT CCC AAA CAC CAA-3（下游）。反应条件为：95 ℃、5 min，然后95 ℃、30 s，58 ℃、30 s，72 ℃、30 s，40个循环后，72 ℃、5 min。反应体系（25 μl）含模板约0.1 μg、0.4 μmol各引物、0.2 mmol dNTP、10 mmol 2-巯基乙醇、Mg2+ 1.5 mmol、1.0 UTaqDNA聚合酶、10×反应缓冲液2.5 μl（含硫酸氨）和适量水。为保证检测的可靠性，以正常人外周血淋巴细胞DNA，经SssI甲基转移酶处理过的胎盘DNA和水，分别做非甲基化与甲基化的阳性对照和空白对照。取10 μl PCR扩增产物用3％琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察并照相。

RNA提取及RT-PCR检测mRNA：取－70 ℃存放的上述组织，每份约50 mg，用1 ml TRIzol（按说明书操作）逐步提取总RNA。CDNA第一链合成体系为25 U，每份取总RNA 2 μg，用逆转录酶MLV、oligodT以及相关试剂按说明配成适当浓度，合成cDNA。

根据GenBank中DAPK mRNA序列，用primer premier 5.0设计引物：5-GCC TGG AGA CGG AGA AGA T-3(上游)，5 -AAG TCC CGT GGC TGG TAG A-3（下游），内参照－actin的引物：5-GTG CGT GAC ATT AAG GAG-3（上游），5-CTA AGT CAT AGT CCG CCT-3（下游）。为了确保内参和目的基因的可比性，用primer dropping法（6）进行PCR扩增，即在扩增前先找出各自的平台期，使反应终止于平台期之前的指数增长期。PCR反应体系（25 μl）中含模板cDNA 2.5 μl、10 Buffer 2.5 μl、Mg 1.5 mmol、dNTP 0.4 mmol、0.3 μmol各引物，1 U Taq DNA聚合酶和适量水。反应条件为：95 ℃预变性5 min，然后95 ℃ 45 s，54 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s。先加入DAPK基因引物，程序运行6个循环后再加入－actin引物，共28个循环，然后72 ℃延伸5 min。反应结束后取5 μl产物，用1.5％琼脂糖凝胶（内含EB）电泳，然后用grab-It成像系统照相并分析各条带的吸光度值，以目的基因对β-catin的相对累积光密度值记录结果。

1.4 统计学处理 应用SPSS 10.0软件进行统计学分析，DAPK基因启动子区甲基化与各临床资料之间的关系用χ2检验，非甲基化的癌组织、癌旁及正常颈段食管部组织中mRNA表达的差异用方差分析。

2 结果

42例颈段食管癌组织中，有27例过甲基化，甲基化率为64.3%，甲基化产物为98 bp；5例正常颈段食管部组织均无DAPK基因甲基化；25例癌旁组织中，有6例发生甲基化，且均为相应癌组织中有甲基化的病例。DAPK基因过甲基化在颈段食管癌各病理分级和T分期间差异无统计学意义（P>0.05），而在N分期（N0和N1）间差异有统计学意义（P<0.05）。RT-PCR检测结果示，所有甲基化的肿瘤组织中均无DAPK mRNA表达，而5例正常组织、19例癌旁组织和15非甲基化的颈段食管癌组织中均有其mRNA的表达，差异无显著性（P=0.332）。

3 讨论

目前的研究认为，DNA甲基化是一种新的基因调控机制，即基因序列不发生变化而基因表达受影响。DNA甲基化多数位于CpG岛（CpG二核苷酸聚集区），而CpG岛多集中分布于基因5端启动子区域。基因启动子区CpG岛过甲基化可通过抑制其转录，使该基因失活。Baylin等［2］研究发现，有多种抑癌基因的失活与其5端启动子区CpG岛过甲基化有关。MSP技术敏感性高，且特异性强，假阳性极少见。笔者采用MSP法，检测了颈段食管癌中DAPK基因启动子区甲基化状态。

DAPK是一种调节细胞凋亡的正向调控因子，参与多种细胞凋亡信号传导途径，包括干扰素-γ、肿瘤坏死因子-α、FAS、p53［3］和TGF-β［4］等。DAPK的表达缺失与其基因启动子区域CpG岛高频率过甲基化在造血系统恶性肿瘤［5］、结肠直肠癌［6］、前列腺癌［7-8］、膀胱癌［9］、胃癌［10］、头和颈肿瘤以及其他一些实体瘤中被发现。Jeong等［11］采用甲基化特异性聚合酶链式反应法，发现宫颈癌组织中p16及DAPK的甲基化阳性率分别为57%及44.9%，较正常宫颈组织明显升高。目前有关Barrett食管腺癌的研究中，检测正常食管黏膜及食管腺癌的DAPK基因过甲基化率分别为20%和60%，并且发现DAPK启动子的异常甲基化与DAPK蛋白的表达下降密切相关，而低表达DAPK的癌灶分级分期更高［12］。

本研究结果显示，颈段食管癌中DAPK基因启动子区CpG岛过甲基化与其转录失活有关，可能是颈段食管癌发生的原因之一。在部分癌旁组织中也发现有甲基化，说明DAPK基因启动子区CpG岛过甲基化可能是颈段食管癌发生和发展过程中较早期的分子事件。

本研究表明，颈段食管癌组织中DAPK基因启动子区甲基化率很高（62.7%），而正常颈段食管部黏膜组织中无甲基化，说明颈段食管癌的发生可能与DAPK基因甲基化有关。统计分析显示，DAPK基因甲基化与临床病理分级和T分期无关，而与有无淋巴结转移有关。有研究显示，肺癌细胞株的转移能力与DAPK水平有关，在肺癌细胞株中恢复DAPK的生理水平可抑制其转移能力。Tang等［13］在研究非小细胞肺癌中甲基化与其愈后的关系时发现，DAPK基因过甲基化的肿瘤患者5年生存率（56%）比非甲基化的肿瘤患者（92%）明显降低。同时他还发现当用去甲基化药物52aza2dc处理非小细胞肺癌时，这些细胞中的DAPK重新获得表达和对肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand，TRAIL)的敏感性［14］。这些研究结果表明，DAPK有抑制肿瘤转移的功能。检测肿瘤组织中DAPK基因的甲基化，可为肿瘤预后分析提供理论依据。提示将脱甲基化药物和死亡配体结合应用将会提升抗癌效果。因此，作为一种重要的诱导凋亡作用的蛋白激酶，DAPK在癌症治疗中可作为一种潜在的药物作用靶点［15］。

总之，以往研究已发现多种抑癌基因的启动子区过甲基化与肿瘤发生有关，颈段食管癌中也发现了一些抑癌基因的甲基化，但DAPK基因启动子区过甲基化与颈段食管癌发生的确切关系，还需进一步研究。相信随着研究的深入，抑癌基因启动子区过甲基化将成为肿瘤诊断或预后估计的检测指标。

参 考 文 献

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