菲牛蛭提取物对顺铂治疗S180荷瘤鼠减毒作用的研究

【摘 要】 目的：研究菲牛蛭提取物联合顺铂治疗S180荷瘤鼠效果及其减毒作用。方法：建立S180荷瘤鼠模型10天后，将40只BALB/c小鼠按肿瘤体积随机分为阴性对照组、顺铂组、菲牛蛭提取物组、菲牛蛭提取物+顺铂组。分组后开始给药，连续给药7天，第8天处死各组小鼠，取血清检测肝肾功能指标;取肾脏进行组织病理学检查;剥离肿瘤称重计算抑瘤率。结果：菲牛蛭提取物与顺铂联合使用具有抑制肿瘤生长的作用（P<0.05）。与顺铂组比较，联合用药后菲牛蛭提取物可使S180荷瘤鼠的ALT、AST、TBIL、BUN、CREA含量降低（P<0.05）。结论：菲牛蛭提取物与顺铂联合使用治疗S180荷瘤鼠具有相加作用，同时菲牛蛭提取物可减轻顺铂引起的肝肾毒性。

【关键词】 菲牛蛭;顺铂;S180;抗肿瘤

【中图分类号】R285.5 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2014）13-0012-03

Attenuation effect of manillensis extract on cisplatin in the treatment of mice bearing S180 tumor

HUANG Hong-kun WANG Nuo WANG Yi HUANG Xiao-hong LIU Sheng-lai

XUN Xia LIN Xiao-ting REN Hai-tao KUANG Shao-xiong*

Guangdong Medical Laboratory Animal Center， Foshan 528248，China

Abstract：Objective Manillensis extract combined with cisplatin in the treatment of mice bearing S180 tumor and attenuation effects. Method S180 tumor-bearing mice model for 10 days，fourty BALB/c mice were randomly divided into negative tumor volume in the control group，cisplatin， manillensis extract group， manillensis extract+cisplatin group.After the group began to administration， continuous.administration for 7 days， 10 mice in each group were sacrificed on eighth day， the serum to detect indicators of liver and kidney function; taken for histopathological examination of kidney; peel the tumor weighed to calculate the inhibition rate. Results Manillensis extract in combination with cisplatin inhibited tumor growth （P<0.05）.compared with cisplatin，the combination therapy can extract manillensis ALT S180 tumor-bearing mice， AST， TBIL， BUN， CREA was decreased （P<0.05）. Conclusion Manillensis extract used in combination therapy with cisplatin S180 tumor-bearing mice have an additive effect， while manillensis extract kidney toxicant reduce cisplatin-induced.

Keywords：manillensis; cisplatin; S180; anti-tumor effect

中药水蛭资源具有可持续利用和发展的重要性[1]，而菲牛蛭（Poecilobdella manillensis），别名马尼拟医蛭，俗称金边蚂蟥，隶属于环节动物门、蛭纲、无吻蛭目、医蛭科、牛蛭属[2、3]，作为目前常见吸血类水蛭中个体较大的品种，至今尚未被列入中国药典。现研究表明，菲牛蛭具有抗凝血、抗血栓、降血脂等药理作用[4-7]，提示其有较好的临床应用前景[8]。水蛭、复方水蛭素具有体内外抗肿瘤作用[9、10]，菲牛蛭及其提取物在抗肿瘤方面的研究较少，其对抗肿瘤药物减毒作用方面亦未见报道。作为治疗多种实体瘤一线抗肿瘤药的顺铂，对肿瘤杀伤作用效果显著，但毒副作用明显，尤其是肝肾毒性[11]。本实验旨在研究菲牛蛭提取物联合顺铂治疗S180荷瘤鼠效果，以及其对顺铂减毒的作用。

1 材料

1.1 药物 菲牛蛭提取物（批号：20120730;性状：棕色干粉;含量：500ATU/g抗凝血酶活性单位，由南宁市科康生物技术有限公司提供），为广西菲牛蛭唾液提取物，用时用生理盐水配制成0.3g/ml溶液。注射用顺铂（批号：2011026CF;性状：黄色冻干粉末;齐鲁制药有限公司生产），用时用生理盐水配制成0.5mg/ml溶液。

1.2 试剂及细胞株 总胆红素（TBIL）试剂盒（钒酸盐氧化法）（批号：20130816）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）试剂盒（液体）（紫外乳酸脱氢酶法）（批号：20130826）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）试剂盒（紫外-苹果酸脱氢酶法）（批号：20131026）、尿素（BUN）试剂盒（肌氨酸氧化酶法）（批号：20130526）、肌酐（CREA）试剂盒（肌氨酸氧化酶法）（批号：20130712）、PBS缓冲液（批号：13090905）由广州威佳科技有限公司提供;甲醛溶液（批号：130120，广州市中南化学试剂有限公司）;0.9%氯化钠注射液（生理盐水）（批号：20130512，四川科伦药业股份有限公司）。肉瘤细胞S180，由广东省医学实验动物中心细胞库提供。

1.3 CKX41仪器倒置显微镜，日本奥林巴斯公司;TDL-5-A低速大容量离心机，上海安亭科学仪器厂;ACS电子天平，中山市衡新电子有限公司;0-150游标卡尺，上海台海工量具有限公司;日立7020型全自动生化分析仪，日本株式会社日立高新技术有限公司。

1.4 动物 SPF级雌性BALB/c小鼠，50只，体重18～22g，购自广东省医学实验动物中心，实验动物质量合格证明编号：44007200004558。饲养于广东省医学实验动物中心SPF级动物房内，实验动物使用许可证号：SYXK（粤）2008-0002。饲养温度与湿度：20～26℃，40%～70%，采用10h：14h昼夜间断照明，喂以鼠专用全价颗粒饲料（由广东省医学实验动物中心提供），自由进食饮水。

2 方法

2.1 S180荷瘤鼠模型的建立 复苏S-180小鼠腹水瘤细胞，台盼兰染色活细胞计数，用PBS配成浓度为1×107个/ml的细胞悬液，对2只小鼠腹腔注射0.25ml细胞悬液，注射前用75%的酒精消毒小鼠腹部，且每次注射前需混匀细胞悬液。5d后，无菌抽取小鼠腹水，以PBS配成浓度为5.0×106个/ml的细胞悬液。将检疫合格的BALB/c小鼠先剪去左前肢背部的被毛，再用碘酒消毒，每只小鼠左前肢背部皮下接种0.2ml的5.0×106个/ml的S-180腹水溶液，每次注射前需混匀腹水溶液。

2.2 动物分组 造模10d后，将肿瘤生长均匀且肿瘤体积约100mm3的40只雌性BALB/c小鼠按肿瘤体积随机分为阴性对照组、顺铂组、菲牛蛭提取物组、菲牛蛭提取物+顺铂组，每组10只。

2.3 给药方式及取材 分组后各组小鼠开始给药。阴性对照组按20ml/kg体重灌胃给予生理盐水;顺铂组按5mg/kg体重腹腔注射给予顺铂注射液;菲牛蛭提取物组按6g/kg体重灌胃给予菲牛蛭提取物药液;菲牛蛭提取物+顺铂组按6g/kg体重灌胃给予菲牛蛭提取物药液，同时按5mg/kg体重腹腔注射给予顺铂注射液。每天1次、连续给药7d。

每2～3天测量2次肿瘤长短径;肿瘤体积按公式：V=1/2ab2测量计算，a、b分别表示长和宽;计算相对肿瘤增殖率T/C（%）：针对每一种人癌异体移植瘤模型的抗肿瘤活性评价指标。计算公式如下：T/C%=TRTV/CRTV×100%。（TRTV：治疗组RTV;CRTV：阴性对照组RTV）。根据测量的结果计算出相对肿瘤体积（relative tumor volume，RTV），计算公式为：RTV=Vt/V0。其中V0为分笼给药时（即d0）测量所得肿瘤体积，Vt为每一次测量时的肿瘤体积。

末次给药后24h，取血后颈椎脱臼处死各组小鼠，取肾脏置于10%中性甲醛溶液（pH7.2～7.4）中固定，进行H.E组织病理学检查。剥离肿瘤称重并计算抑瘤率。将小鼠血清置于-80℃保存，用于检测血清中ALT、AST、TBIL、CREA、BUN含量。

肿瘤生长抑瘤率（%）=（阴性对照组平均瘤重﹣治疗组平均瘤重）/阴性对照组平均瘤重×100%。

2.4 菲牛蛭提取物对顺铂治疗S180荷瘤鼠的联合效应 根据金正均公式[12]计算菲牛蛭提取物与顺铂联合用药效应：两药合用抑制率：q值=[E（a+b）]/[Ea+Eb-Ea×Eb]。Ea、Eb：表示两药单用时各自的抑瘤率，q<0.85说明两药合用有拮抗作用;q≥1.15说明两药有协同作用;0.85

2.5 统计学方法 采用SPSS 21.0软件进行统计分析，数据以均数±标准差表示，组间比较采用方差分析、Student-Newman-Keuls方法进行统计分析，P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 菲牛蛭提取物联合顺铂对S180荷瘤鼠肿瘤体积的影响 表1显示，与阴性对照比较，分组时各组小鼠肿瘤体积均匀。给药第6、8d时，顺铂组及菲牛蛭提取物+顺铂组肿瘤体积明显缩小（P<0.05），菲牛蛭提取物组肿瘤体积有缩小趋势。

图1显示，各组相对肿瘤增殖率T/C（%）随着给药时间延长不断下降，以顺铂组和菲牛蛭提取物+顺铂组下降更显著。

3.2 菲牛蛭提取物联合顺铂对S180荷瘤鼠的肿瘤质量和抑瘤率的影响 表2显示，与阴性对照组比较，顺铂组肿瘤质量显著下降（P<0.05），菲牛蛭提取物组肿瘤质量下降，菲牛蛭提取物+顺铂联合用药组肿瘤质量显著下降（P<0.05）。

3.3 菲牛蛭提取物对顺铂治疗S180荷瘤鼠的联合效应 根据金氏公式，以及各给药组的抑瘤率计算。菲牛蛭提取物+顺铂组的联合效应如下：q值=0.7792/（0.8662+0.2869-0.8662×0.2869）=0.8614>0.85，说明菲牛蛭提取物与顺铂具有相加作用。

3.4 对顺铂治疗S180荷瘤鼠血清中肝肾功能指标的影响 表3显示，与阴性对照组比较，顺铂组的ALT、AST、TBIL、CREA和BUN含量明显升高（P<0.05）。与顺铂组比较，菲牛蛭提取物+顺铂组联合用药后可使S180荷瘤鼠ALT、AST、TBIL、CREA和BUN含量降低（P<0.05）。

3.5 菲牛蛭提取物对顺铂治疗S180荷瘤鼠肾脏组织病理的影响 阴性对照组、菲牛蛭提取物组肾脏组织病理（HE染色）显示其肾脏结构正常，无病理变化。顺铂组10只小鼠均可见出现少量肾小管透明管型、蛋白管型;菲牛蛭提取物+顺铂组10只小鼠仅6例出现少量肾小管透明管型、蛋白管型，说明联合用药后菲牛蛭提取物可减少肾脏透明管型的出现或使其出现时间延长。

4 讨论

目前，恶性肿瘤已成为威胁人类生命健康的疾病之一。在对恶性肿瘤的治疗中，顺铂是目前最成功的化疗药物之一，其治疗肿瘤种类广泛，具有很高的治愈率。但使其使用受限的因素有两个：一是获得性肿瘤耐药性;二是顺铂严重的毒副作用，尤其是肾毒性[13]。因此在顺铂治疗肿瘤的过程中，如何不影响甚至增强其疗效的同时减轻其毒副作用是目前临床面临的问题。

现代药理研究证实，水蛭具有抗肿瘤作用，对癌瘤生长有抑制、破坏作用，水蛭还有抗高凝作用，有利于抗癌药及免疫活性细胞侵入癌组织而杀伤癌细胞。本研究显示，菲牛蛭提取物单独使用对S180荷瘤鼠的肿瘤生长具有抑制肿瘤生长的趋势，与顺铂联合用药后，其抑瘤效果比单用菲牛蛭效果明显。经计算说明菲牛蛭提取物与顺铂具有相加的抗肿瘤作用。另外，给药7d后，顺铂组的ALT、AST、TBIL、BUN、CREA肝肾功能指标显著升高，菲牛蛭提取物联合顺铂用药，小鼠各项肝肾功能指标均明显下降，提示顺铂对S180荷瘤鼠具有一定的肝肾毒性作用，而菲牛蛭提取物在一定程度上能够拮抗顺铂对S180荷瘤鼠的肝肾毒副作用。而菲牛蛭提取物对顺铂治疗S180荷瘤鼠减毒的具体机制还有待进一步的研究。在本研究过程中还发现，菲牛蛭提取物并不能完全缓解由顺铂引起的小鼠体重减轻情况;另外顺铂毒副作用较广，本研究仅涉及其肝肾毒性方面，对其他毒性是否具有减轻作用仍有待进一步研究。本研究还进行了菲牛蛭提取物急性毒性研究，采用最大给药量法18g/kg体重剂量灌胃给予小鼠，观察14d未见出现毒性表现，体重正常增长。说明菲牛蛭提取物本身毒性较低，综合其药理作用，继续开发利用菲牛蛭具有较高的应用价值。由于菲牛蛭提取物为菲牛蛭唾液提取，属于粗提物，唾液粗提物成分较广，若能进一步分离纯化提取出其抗肿瘤成分及其减毒成分，对进一步研究其抗肿瘤等作用具有重要意义。

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（收稿日期：2014.04.25）