牵牛子酒提取物对Lewis肺癌的抗肿瘤和抗转移机制研究

材料

1.1 动物 C57BL/6小鼠，雄性，体重18～22 g，北京维通利华试验动物有限公司提供，实验动物合格证号SCXK（京）20090002。饲养于河南大学实验动物中心，自由饮食及饮水。

1.2 中药制备 牵牛子购自开封市天济堂药店，经河南大学药学院丛悦教授鉴定为旋花科植物牵牛P. nil的种子。牵牛子酒提取物由本校药物研究所制剂室制备：牵牛子粉碎过40目筛，加入10倍量体积分数52%的泸州老窖白酒60 ℃超声提取40 min，抽滤，提取2次，合并2次抽滤液，减压浓缩致干，用时加水溶为所需浓度供动物实验用，水溶液无菌过滤后供细胞实验用。

1.3 试剂与仪器 DMEM培养基（美国Gibco-BRL）；MTT（美国Sigma公司）； 标准胎牛血清（天津市源洋生物制品科技有限责任公司）；荧光黄（LY）（美国Sigma公司）；Cx43和AQP1兔抗鼠多克隆抗体（武汉博士德生物工程有限公司）；羊抗兔IgG-HRP（武汉博士德生物工程有限公司）；HDL洁净台（北京东联哈尔仪器制造有限公司）；UV-2000型紫外-可见光分光光度计（上海尤尼柯仪器有限公司）； LGR16-W型高速冷冻离心机（北京京立离心机有限公司）；800型酶标仪（Bio-Tek）；DYY-7C电泳仪；XDS-500D型倒置荧光显微镜（上海蔡康光学仪器有限公司）。

2 方法

2.1 细胞增殖检测 取对数生长期的LLC细胞，用0.25%胰酶消化，调整细胞数5×10⁴个/mL，以每孔100 μL接种于96孔板中。细胞于含10% 胎牛血清的DMEM培养基中5%CO₂，37 ℃培养24 h后添加含不同浓度牵牛子酒提取物（终浓度以牵牛子计为0，7.5，15，30，60，120 mg·L^-1 ）的同一培养基，每孔100 μL，每组6个复孔。48 h后，除去培养基，加含MTT 0.5 g·L^-1的PBS 每孔100 μL，继续培养4 h后除去孔内的液体，加入DMSO每孔100 μL，震荡10 min，在酶标仪上570 nm处测吸光度A，抑制率=（A_不加药组-A_加药组）/A_{不加药物组}×100%。

2.2 细胞迁移实验 取对数生长期的LLC细胞，用0.25%胰酶消化，调整细胞数3×10⁵个/mL，以每孔2 mL接于6孔板中，细胞于含10%胎牛血清的DMEM培养基中5%CO₂，37 ℃培养，待细胞长满后，用10 μL微量移液器枪头在其中划痕，用培养基冲洗后添加含不同质量浓度牵牛子酒提取物（0，7.5，15 mg·L^-1）的低血清DMEM培养基（含胎牛血清2%）每孔2 mL， 每组设3个平行孔， 分别于划痕后0，24 h拍照，利用显微镜拍照程序测量划痕宽度，每条划痕测量3次，取其平均值。细胞迁移距离=划痕后初始宽度-划痕后24 h宽度。