白花蛇舌草对裸鼠宫颈癌细胞增殖和凋亡的实验研究

[摘要] 目的：探究白花蛇舌草对宫颈癌的抑制作用及可能的分子生物学机制。方法：建立裸鼠人宫颈癌细胞移植模型及采用胃内灌药。当肿瘤生长至直径10 mm时，将荷瘤鼠随机分组，比较给药组与对照组在抑瘤率、生存时间、HeLa细胞Ki-67抗原蛋白的表达率以及肿瘤组织凋亡上的差异。结果：白花蛇舌草对HeLa细胞移植瘤生长有明显抑制作用，并可诱导HeLa细胞凋亡，Ki-67蛋白的表达下降(P<0.05)，并明显延长荷瘤小鼠的平均生存时间(P<0.05)。结论：白花蛇舌草通过直接抑瘤增殖和诱导、促进肿瘤细胞凋亡，实现了其清热解毒、软坚散结的作用。

[关键词] 白花蛇舌草；宫颈癌；细胞增殖；凋亡；Ki-67

[中图分类号] R-332 [文献标识码]A [文章编号]1674-4721（2010）10（c）-０05－０4

The study of Hedyotis diffusa for its effects on proliferation and apoptosis of the cervical tumor in nude mouse model

ZHANG Peiying 1, WANG Yeqiao2, XU Xia 3, WANG Zhongliang 3, ZHANG Bei2, GU Juan2, HAO Lin2, HAN Conghui2*,WU Mianhua4*

(1.Department of Traditional Chinese Medicine, Central Hospital of Xuzhou City, Jiangsu Province, Xuzhou 221000, China; 2.Reproduction Medicine Center, Dongnan University (Xuzhou), Jiangsu Province, Xuzhou221000, China; 3.Department of Gynecology, Xuzhou Hospital of Chinese Medicine, Jiangsu Province, Xuzhou221000, China; 4.The First Clinical Hospital, Nanjing University of Chinese Medicine, Jiangsu Province, Nanjing 210046, China)

[Abstract] Objective: To explore the inhibitory effect of Hedyotis diffusa on cervical cancer and its possible mechanism of molecular biology. Methods: Human cervical carcinoma xenograft in nude mouse model was established and the stomach perfusion was used for the treatment. When the tumor grew to 10 mm, the mice were randomly divided. Studies for comparison between the experimental groups and the control were done on the tumor-inhibiting rate, the survival duration, the expression of Ki-67 protein, and the apoptosis of the tumor tissue. Results: Hedyotis diffusa has an inhibitory effect on cervical cancer cells and induces apoptosis in HeLa cells. The expression of Ki-67 protein decreased(P<0.05), and the mean survival time of the mice was prolonged (P<0.05). Conclusion: Hedyotis diffusa can directly inhabit cervical tumor proliferation and induce apoptosis of the tumor. It has a positive effect for the treatment of cervical cancer.

[Key words] Hedyotis diffusa; Cervical cancer; Cell proliferation; Apoptosis; Ki-67

目前对于宫颈癌早期主要采用手术治疗或放射治疗，对于中晚期以及复发、转移的宫颈癌患者多采用放射治疗结合全身化疗的治疗手段。临床发现，不同患者之间，其放化疗敏感性存在差异，导致治疗效果亦有很大不同。提高放化疗的剂量虽然在一定程度上可以提高疗效，但是不同患者的耐受性不同，并且毒副作用明显增加，严重降低患者的生活质量。

白花蛇舌草为茜草科一年生草本植物，具有清热解毒、活血化瘀、利尿通淋等功能。现代研究表明，白花蛇舌草主要化学成分有熊果酸、免疫多糖、乌索酸、白花蛇舌草素等，这些主要的有效成分具有增强免疫活性和抗肿瘤活性。临床观察发现白花蛇舌草对宫颈癌疗效显著。Ki-67是一种核增殖标志基因，在宫颈癌等多种肿瘤高表达，这种高表达状态与肿瘤的发生、发展、复发以及对放化疗产生的抵抗性密切相关。本实验拟利用高表达Ki-67蛋白的宫颈癌细胞株HeLa为研究对象，利用动物血清学的原理，研究白花蛇舌草对宫颈癌细胞增殖和凋亡的影响及Ki-67基因的表达，探究白花蛇舌草对宫颈癌抑制作用及可能的分子生物学机制，为白花蛇舌草的进一步研究及临床应用提供实验依据,奠定理论基础。

1材料与方法

1.1 实验动物

BALB/C-nu裸鼠（购自中国科学院上海实验动物中心），40只，雌性，体重18~20 g，饲养于徐州医学院实验动物中心恒温(22~25℃)、恒定湿度的SPF（specific pathogen free condition）层流罩中。经高压灭菌的标准饲料和水供动物自由饮食。动物喂养时采用架式不锈钢鼠笼喂养。自然通风，饲料为纯鼠颗粒饲料，饮用水为清洁自来水。实验室温度为19~29℃，相对湿度为40%~80%。

1.2 实验药品与试剂

白花蛇舌草300 g [由南京中医药大学中西医结合临床学院（徐州市中心医院）中药房提供]，RPMI-1640+10%胎牛血清(加双抗青霉素100 U/ml 和链霉素100 μg/ml)、0.125%的胰蛋白酶(购自美国GBICO公司)，Ki-67免疫组化试剂盒、TUNEL试剂盒、Ki-67一抗 (rabbit antibody)试剂盒（购自北京中山公司），RNA提取及RT-PCR试剂盒（购自美国Santa Cruz公司和Promega 公司）。细胞培养和各种抗瘤实验在无菌无毒的操作环境进行，所用实验室为东南大学（徐州）生殖医学研究所层流实验室。

1.3 实验方法

1.3.1 裸鼠宫颈癌移植模型的建立

裸鼠40只，雌性，4~6周龄，体重18~20 g，购于中国科学院上海实验动物中心。裸鼠饲养于恒温(22~25℃)、恒定湿度的SPF（specific pathogen free condition）层流罩中。经高压灭菌的标准饲料和水供动物自由饮食。培养的HeLa细胞经胰酶消化后离心，用PBS液清洗2次；将细胞团块吹散，经台盼蓝实验证实细胞活力大于95%；取HeLa细胞2×106个(0.2 ml) 接种于裸鼠背部皮下组织内，动物继续饲养于层流罩内，观察2周，成瘤率为100%。

1.3.2实验动物分组与给药

当肿瘤生长至直径10 mm时开始实验，将荷瘤鼠随机分为两大组，每组20只小鼠，再随机分成两个小组，分别用于观察抑瘤率和生存时间。①对照组：荷瘤鼠不加以治疗，继续饲养至实验结束（n=10）；②白花蛇舌草组（实验组）：白花蛇舌草水煎液灌胃，以5.0 ml/（kg·次·只）给药，1次/d，共10次（n=10）。白花蛇舌草灌胃水煎液制备：白花蛇舌草300 g加水3 000 ml，温火煎煮2 h，去渣浓缩为300 ml备用。

1.3.3观察指标和检测

1.3.3.1抑瘤率观察荷瘤对照组裸鼠（n=10）不加以治疗，继续饲养至实验10 d。给药组（n=10）：白花蛇舌草水煎液灌胃，每天1次，第10天停止给药，次日采用颈椎脱臼法杀死小鼠后，在无菌条件下取出小鼠肿瘤分别称重，计算抑瘤率。抑瘤率=（C﹣T）/C×100%。其中T为实验组平均瘤重，C为对照组平均瘤重，称重后组织常规固定进行病理检查。

1.3.3.2生存时间观察对照组和白花蛇舌草组（n=10），喂养动物直至死亡，计算荷瘤小鼠的平均生存时间。

1.3.3.3小鼠宫颈癌肿瘤组织Ki-67蛋白表达免疫组化检测将裸鼠肿瘤组织石蜡包埋切片，常规二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水，接着浸入配制好的柠檬酸/柠檬酸钠中，95℃水浴10 min，后用0.3% H2O2室温作用30 min，消除内源性辣根过氧化物酶活性。PBS洗后用血清封闭，室温1 h后PBS洗1遍，上一抗（Ki-67抗体，1∶100）4℃ 48 h。48 h后吸去一抗，PBS洗3遍，以后的操作按Vect ABC试剂盒进行，即生物素标记的二抗4℃过夜，PBS洗3遍，辣根过氧化物酶（HRP）标记的生物素卵白素复合物，37℃ 1 h。PBS洗4遍，最后DAB显色，镜检控制结果。然后梯度酒精脱水、二甲苯透明，中性树脂封片，光镜下观察。

每批染色均设阳性对照与阴性对照，用已知阳性片作阳性对照，对照实验为以磷酸缓冲液(PBS)代替一抗，其余操作相同。

1.3.3.4小鼠宫颈癌肿瘤组织凋亡检测（TUNEL法）采用ApopTagR Peroxidase In Situ Apoptosis Detection 试剂盒，按说明书操作行TUNEL染色。石蜡包埋切片（5 mm），常规二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水，蛋白酶K20 μg/ml室温消化20 min, 在TdT酶和核苷酸混合液中孵育37℃ 1 h，用stop/wash buffer 停止反应，在anti-digoxigenin conjugate室温孵30 min，最后DAB显色，苏木素复染，梯度酒精脱水、二甲苯透明，中性树脂封片，光镜下观察。凋亡细胞核呈现棕黄色。

1.4统计学方法

实验结果以均数±标准差(x±s)表示，采用t检验或方差分析，以SPSS 14.0软件处理。

2结果

2.1白花蛇舌草对HeLa细胞荷瘤小鼠抑瘤率的影响

用白花蛇舌草水煎液灌胃，可明显抑制宫颈癌HeLa细胞肿瘤的生长，未经治疗的对照组的平均瘤重为（1.61±0.30） g，而经白花蛇舌草治疗的HeLa细胞荷瘤小鼠平均瘤重为（1.03±0.26） g，抑瘤率为36.1%，实验组瘤体减小与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。如图1。

2.2白花蛇舌草对宫颈癌HeLa细胞荷瘤小鼠平均生存时间的影响

未经治疗的对照组的平均生存时间为（13.3 ±1.1） d，而经白花蛇舌草治疗的HeLa细胞荷瘤小鼠平均生存时间为（19.4 ±1.9） d，生存时间延长率（％）为46.6%。P< 0.05，差异有统计学意义。对照组的最长生活时间为25 d，而白花蛇舌草治疗组最长的生存时间为34 d。如图2。

2.3 白花蛇舌草对宫颈癌荷瘤小鼠HeLa细胞Ki-67抗原蛋白的表达率

免疫组化检测肿瘤组织Ki-67蛋白的表达率，阳性标准：Ki-67抗原蛋白表达阳性细胞表现为细胞核出现黄色或棕黄色着色。阴性为无角质形成细胞着色或角质形成细胞着色<5%。如图3。

对照组Ki-67表达的阳性细胞反应定位于细胞核，多呈黄色、深黄色和棕黄色颗粒，表达率为72％；而白花蛇舌草治疗组则没有此种表现，Ki-67的表达率仅为21.2％。

Ki-67蛋白表达阳性计数方法：放大400倍镜下计数5个视野，阳性细胞率=阳性细胞数/总细胞数×100%。阳性细胞数在5%~25%为(+)，26%~50%为(++)，51%~75%为(+++)，>75%为(++++)。阳性细胞反应定位于细胞核，多呈黄色和棕黄色颗粒，对照组Ki-67的表达率仅为21.2%，而白花蛇舌草治疗组的Ki-67的表达率为72％，两者相比，P<0.05，差异有统计学意义。见图4。

2.4白花蛇舌草对宫颈癌荷瘤小鼠HeLa细胞凋亡的影响

经TUNEL法检测，透射电镜观察显示，对照组小鼠的肿瘤组织无明显变化，而在实验组肿瘤瘤块内出现大面积的细胞坏死，坏死细胞结构不清、核深染、同时可见变小凋亡细胞以及核固缩等细胞凋亡征象，见图5。

白花蛇舌草实验组宫颈癌肿瘤细胞凋亡率为（60.43±0.17）%，与对照组凋亡率（3.09±0.21）%比较，差异有统计学意义(P<0.05)，见图6。

3讨论

恶性肿瘤是严重威胁人类健康的一类常见疾病，临床治疗肿瘤，西医一般采用手术、放疗、化疗三大疗法，疗效快捷，

对早中期肿瘤有一定的根治效果，但存在明显的损伤和毒副作用。因此，寻找有效且无损伤和毒副作用的抗癌药物，寻找有效的药物和方法，是医学领域面临的重要问题。中草药是我国的传统医药,对于肿瘤的治疗，中药具有改善症状明显，副作用小等特点。中医认为，癌症的重要病理基础为正气虚衰、热毒内聚，恶性肿瘤临床常见症状、体征为发热、局部肿块增大、灼热、疼痛、口渴、尿黄、大便干结、舌质红苔黄、脉数等，都属于邪热瘀毒之象，故治疗以清热解毒为法则[1]。合理应用中医药，可对人体失衡的内环境进行调节，使正气内存，提高机体抗御力，在改善患者的生存质量、延长生存期、控制病情发展等方面起到重要作用，日益受到重视和肯定。

宫颈癌作为目前最常见的女性恶性肿瘤，目前治疗上多采用放疗、手术或综合治疗等方法。但宫颈癌的治疗预后效果不佳，手术治疗后易发生复发转移。早期宫颈癌因癌肿较小，未发生扩散转移，手术切除是最为有效的治疗手段，早期宫颈癌首选广泛性全子宫切除，通常配合盆腔淋巴结清除术以消除邻近的癌变组织。术后一定时间内可采取放化疗、中医药等治疗等手段以防止复发。而中晚期宫颈癌的治疗现状并不乐观，应根据病程发展状况及患者身体功能状况选择恰当的治疗手段。临床上，中晚期宫颈癌的治疗方法主要有放化疗及中医药治疗。放射治疗的方法视患者的具体情况而有所不同，多采用内外放射结合。化疗则多采用联合放疗，在各种化疗药物中，顺铂是治疗中晚期宫颈癌应用最广和比较有效的药物，它具有化疗药物及放射增敏剂的双重作用。但随着化疗时间的延长，治疗毒性也在逐渐增加，因此，化疗药物及化疗时间应依据肿瘤缓解情况、症状缓解情况以及治疗相关性毒性而定。在临床应用中有着诸多的局限性。

随着对祖国医学的研究不断深入，中医药在宫颈癌临床治疗中的效果越来越受到关注。在植物中寻找有效而副作用小的抗肿瘤药物已成为国内外重要的课题，关于中药抗肿瘤机制的研究方兴未艾。在中晚期宫颈癌的治疗中可合并中医药治疗，以起到增效减毒的作用。对于转移范围广，身体功能弱，已经难以耐受化疗的中晚期宫颈癌患者，可用中医药进行保守治疗，增强机体的免疫功能，提高对肿瘤的抵抗能力。虽然短期效果没有化疗明显，但远期效果好，在改善生存质量，延长生存期方面效果明显。

白花蛇舌草(Hedyotis diffusa Willdl)为茜草科一年生草本植物白花蛇舌草的全草。在中国主要分布于南方各省区，夏秋季节采收，洗净，鲜用或晒干。其味微苦、微甘，性凉，入心、肝、肺经，具有清热、解毒、利湿、抗癌等功效。近年来许多学者对白花蛇舌草进行了广泛的研究，特别是对其化学成分、药理作用和临床应用等方面的研究更为深入，揭示白花蛇舌草具有广泛的药理活性，其中增强免疫功能与抗肿瘤活性引起许多学者和临床医生的极大关注。作为癌症的辅助治疗有较好的疗效，已被用来临床治疗各类肿瘤：如原发性支气管癌、肺癌、直肠癌、鼻咽癌、肝癌、食管癌、淋巴癌、卵巢子宫内膜样癌、胃癌等[2]。在体外实验的研究中也显示白花蛇舌草对多种肿瘤细胞株具有增殖抑制作用[3-4]。如李雨成等[5]发现白花蛇舌草对膀胱癌EJ细胞的增殖有显著的抑制作用,且在一定的剂量范围内呈浓度、时间依赖性。李洁等[6]研究表明白花蛇舌草能有效地抑制肝癌H22肿瘤的生长,并能显著加强化疗药DDP 的抑瘤效果。尽管现代研究已经证明白花蛇舌草对肿瘤细胞有肯定的抑制作用。但具体的抗肿瘤机制尚不明了。

本课题观察了白花蛇舌草提取物对宫颈癌HeLa细胞荷瘤小鼠肿瘤生长的抑制作用，并通过观察白花蛇舌草对肿瘤组织细胞增殖相关基因Ki-67表达的抑制情况，探讨和分析白花蛇舌草抗肿瘤的具体机制，从而为白花蛇舌草的临床应用和抗肿瘤新药的开发和研制提供依据。

在动物实验中，用白花蛇舌草水煎液灌胃，可明显抑制宫颈癌HeLa细胞肿瘤的生长，未经治疗的对照组的平均瘤重明显低于给药组，抑瘤率为36.1%。未经白花蛇舌草处理的对照组小鼠的肿瘤组织无明显变化，而在经白花蛇舌草处理的实验组肿瘤瘤块内出现大面积的细胞坏死，坏死细胞结构不清、核深染、同时可见变小凋亡细胞以及核固缩等细胞凋亡征象。白花蛇舌草实验组宫颈癌肿瘤细胞凋亡率明显高于对照组。未经白花蛇舌草治疗的对照组的平均生存时间明显缩短，实验组生存时间延长率为46.6%。

以往的研究表明，子宫颈癌的发生是多因素协同作用的结果，组织学改变是由鳞状上皮单纯性增生、不典型增生、原位癌到浸润性癌的渐进性癌变过程。现已知HPV属乳多空病毒科A亚群内的一组DNA病毒，其致癌作用与HPV-DNA的整合有关。HPV感染宿主细胞后，首先潜伏在黏膜表面的基底层细胞，在棘层细胞和颗粒层的分化角质细胞中复制，病毒核酸整合到宿主细胞内，使宿主细胞发生突变，整合后的DNA发生致癌作用的主要基因为E6、E7和E2，其中E6和E7干扰细胞增殖周期，使细胞无限增殖，这是目前认为HPV导致子宫颈癌发生的分子学基础。研究同时发现HPV的感染和Ki-67抗原的表达具有明显的相关性[7-9], 表明宫颈癌的发生与细胞增殖有关。这对我们研究和治疗宫颈癌找到了一个突破口，如果能抑制Ki-67的表达，就能抑制宫颈癌细胞的增殖，最终达到癌细胞凋亡的目的。Ki-67基因是一细胞增殖相关基因，所编码的Ki-67蛋白是肿瘤细胞增殖所必需的DNA结合蛋白，其在G1中晚期出现，经S、G2期在M期达到高峰，M期后即快速降解。Ki-67抗原是一种贯穿表达于增殖期细胞中的核抗原[10]。Ki-67高增殖指数与许多肿瘤(乳腺癌、淋巴瘤、内分泌肿瘤等)的分化程度、浸润转移及预后有关，是恶性肿瘤预后的参考指标之一[11]。曾永群等[12]研究结果显示宫颈腺癌Ki-67 高表达占59.3%、中表达占7.4%、低表达占33.3% ,腺体增生组则无一例表达，提示Ki-67高表达可作为恶性病变的佐证,有助于鉴别异型性不明显的高分化腺癌。

笔者采用RT-PCR检测Ki-67 mRNA表达，发现不同剂量的白花蛇舌草药物血清对宫颈癌HeLa细胞的Ki-67 mRNA表达与对照组有明显的抑制作用。实验组随着白花蛇舌草药物浓度的增加以及作用时间的延长，HeLa细胞Ki-67 mRNA表达率逐渐降低，而对照组随着时间的延长，Ki-67 mRNA的表达无明显变化。结果表明白花蛇舌草对HeLa细胞Ki-67 mRNA的表达有着一定的量效关系，随着剂量的增加，药物作用时间的延长，Ki-67 mRNA表达有明显的下降。

同时，笔者用细胞免疫组化检测的方法，发现不同剂量的白花蛇舌草药物血清对宫颈癌HeLa细胞Ki-67抗原的表达有明显的抑制作用。实验组随着白花蛇舌草药物浓度的增加以及作用时间的延长，HeLa细胞Ki-67蛋白的表达率逐渐降低，而对照组随着时间的延长，Ki-67蛋白的表达无明显变化。结果表明白花蛇舌草对HeLa细胞Ki-67蛋白的表达同样存在着一定的量效关系。

本研究显示白花蛇舌草含药血清对宫颈癌HeLa细胞的增殖起到明显的抑制作用(P<0.05)，并具有剂量和时间依赖性，随药物剂量的增加，作用时间延长，抑瘤作用增强。体内外宫颈癌细胞Ki-67抗原表达的显著抑制提示了白花蛇舌草的抑瘤增殖作用机制。白花蛇舌草含药血清处理的体外培养的宫颈癌细胞出现了明显的细胞凋亡(P<0.05)，同样具有剂量和时间依赖性。白花蛇舌草水煎液灌胃使荷瘤小鼠瘤体内的肿瘤细胞出现了明显的细胞凋亡(P<0.05)。白花蛇舌草水煎液灌胃能够明显地抑制肿瘤生长并延长荷瘤动物的生存时间。

因此，笔者认为：白花蛇舌草是通过其直接抑瘤增殖和诱导、促进肿瘤细胞凋亡实现了其清热解毒、软坚散结作用的。

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（收稿日期：2010-08-25）