角质细胞生长因子对口腔黏膜上皮细胞凋亡的作用研究

[摘要] 目的 研究不同浓度角质细胞生长因子（KGF）对口腔黏膜上皮细胞凋亡的作用，为探讨KGF在口腔黏膜病发生发展中的作用提供依据。方法 将不同浓度的KGF（对照组0 ng·mL-1，实验1组5 ng·mL-1，实验2组25 ng·mL-1，实验3组50 ng·mL-1）分别加入体外培养的口腔黏膜上皮细胞，培养12、24、48 h后，倒置显微镜下观察其对细胞形态的影响，并用流式细胞仪检测细胞凋亡情况，荧光实时定量检测细胞凋亡相关基因Bcl-2、Bax mRNA的表达水平。结果 1）实验组较对照组细胞贴壁明显，且48 h时实验3组细胞核仁明显。2）培养48 h时，4组之间的细胞凋亡率、Bcl-2 mRNA、Bax mRNA表达均有统计学差异，随着KGF浓度的增加，细胞凋亡率和Bax mRNA表达逐渐降低，Bcl-2 mRNA表达逐渐升高（P<0.05）。结论 KGF可通过上调Bcl-2 mRNA和下调Bax mRNA的表达抑制上皮细胞的凋亡。

[关键词] 角质细胞生长因子； 细胞凋亡； 口腔黏膜上皮细胞

[中图分类号] R 783.5 [文献标志码] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.06.005

细胞凋亡与口腔疾病的发生密切相关[1]。角质细胞生长因子（keratinocyte growth factor，KGF）为碱性成纤维细胞生长因子家族的一员，由间质细胞分泌，通过旁分泌的途径作用于上皮细胞。在本课题组前期的研究中，发现KGF与口腔黏膜上皮细胞的增殖和凋亡密切相关[2]，KGF在口腔黏膜上皮的颗粒层及棘层上皮细胞的表达水平较高。本研究将不同浓度的KGF作用于培养的人口腔黏膜上皮细胞，检测其对口腔黏膜上皮细胞凋亡相关基因Bcl-2、Bax mRNA表达水平的影响，探讨其在口腔黏膜病的发生、发展及治疗中的作用。

1 材料和方法

1.1 细胞来源

人口腔黏膜上皮细胞系由山东省口腔生物医学重点实验室提供，来源于日本早稻田大学，取第3～10代的细胞用于实验。

1.2 主要仪器和试剂

改良无血清培养基D-KSFM（GIBICO公司，美国），Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒（中国Best-Bio公司），SYBR Premix Ex TapTM[宝生物工程（大连）有限公司]，KGF（Prospec公司，美国），荧光定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）仪ABI7500（Bio-Rad公司，美国），流式细胞仪 EPICS XL（Beckman公司，美国）。

1.3 口腔黏膜上皮细胞的培养及鉴定

从液氮中取出细胞冻存管后，迅速放入到37 ℃水浴中，轻振荡使其快速解冻。在紫外灯照射30～

40 min并通风10 min的超净台中，将冻存管内细胞悬液移入离心管后加入5～10 mL含10%胎牛血清及1%双抗的培养液。离心800 r·min-1 8 min。去除上清后加入培养液吹打成细胞悬液，接种。在37 ℃、5%

CO2培养箱中培养。复苏第2天更换培养液，每3天换液1次，待细胞生长到覆盖瓶底壁80%时传代。

口腔黏膜上皮细胞体积较小，贴壁生长，呈扁平的卵圆形或多角形如铺路石状。荧光角蛋白免疫组化标记阳性。

1.4 口腔黏膜上皮细胞分组

取对数期口腔黏膜上皮细胞进行传代培养，待细胞密度达到70%～80%融合时，加入D-KSFM培养24 h，去除原培养液，根据实验分组分别加入含不同浓度KGF（实验1组5 ng·mL-1，实验2组25 ng·mL-1，实验3组50 ng·mL-1）的D-KSFM，对照组加入等体积无菌PBS（0 ng·mL-1KGF）。

1.5 KGF对细胞形态的影响

各组细胞培养12、24、48 h后，在倒置显微镜下进行细胞形态学观察。

1.6 流式细胞仪检测细胞凋亡率

各组细胞培养48 h后，胰酶消化，收集细胞悬液，用预冷的PBS洗涤细胞2次（2 000 r·min-1，5 min）。用400 μL 1×Annexin V结合液悬浮细胞，浓度为每毫升1×106个细胞；加入5 μL Annexin V-FITC染色液，轻轻混匀后于2～8 ℃避光孵育15 min；加入10 μL PI染液后轻轻混匀，2～8 ℃避光下孵育5 min，1 h内用流式细胞仪进行检测。右上象限（FITC+/PI+）代表晚期凋亡和坏死细胞，右下象限（FITC+/PI-）代表早期凋亡细胞，左下象限（FITC-/PI-）代表活细胞。

1.7 荧光实时定量检测细胞凋亡相关基因Bcl-2、BaxmRNA的表达

各组细胞培养12、24、48 h后，收集细胞并提取各组细胞总RNA，经RNA浓度及纯度检测后，用逆转录试剂盒逆转录成cDNA。荧光Real-Time PCR反应体系：SYBR® Premix Ex TaqTM （2×）10 μL，PCR上游引物（10 μm）0.4 μL，PCR 下游引物（10 μm）0.4 μL，ROX Reference Dye Ⅱ（50×）0.4 μL，DNA模版2.0 μL，dH2O 6.8 μL。以GAPDH为内参，用ABI 7500 Real-Time PCR System仪器，在8联管中进行Real-Time PCR反应，反应条件：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火60 s，72 ℃延伸45 s，共40个循环，72 ℃末次延伸5 min。引物序列见表1。所有反应在ABI7500型实时荧光定量PCR仪上进行，每个样本检测均重复3次，取其平均值。存储荧光信号，绘制扩增曲线，得出各样本的扩增循环数（cycle number，Ct）。采用2-ΔΔCt 法计算LOX-1 mRNA 的相对表达量，ΔCt=目的基因Ct值-内参Ct值，-ΔΔCt=空白对照组ΔCt值-实验组ΔCt值。

1.8 统计分析

采用SPSS 16.0软件进行统计，对检测结果进行单因素方差分析和t检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 KGF对细胞形态的影响

各组口腔黏膜上皮细胞在37 ℃、5%CO2培养箱中培养12、24、48 h后，倒置显微镜下观察，可见实验组较对照组细胞遮光性强，细胞贴壁明显；与其他各组相比，培养48 h时的第3组细胞遮光性明显增强，且细胞核仁明显，各组细胞未见明显的形态改变。

2.2 细胞凋亡

口腔黏膜上皮细胞培养48 h后，实验1组、2组、3组及对照组的细胞凋亡率分别为4.63±0.31、2.60±0.26、1.60±0.36、6.60±0.65。统计分析显示，4组之间的细胞凋亡率均有统计学差异，随着KGF浓度的增加，细胞凋亡率逐渐降低（P<0.05）。

2.3 Bcl-2 mRNA的表达

不同培养时间各组细胞Bcl-2 mRNA的表达见表2。培养12 h时，实验1、2组较对照组Bcl-2 mRNA表达无统计学差异，实验3组Bcl-2 mRNA表达显著增加（P<0.05）；培养24 h时，3个实验组较对照组的Bcl-2 mRNA表达均显著增加（P<0.05），但各实验组间无统计学差异；培养48 h时，4组之间均有统计学差异，随着KGF浓度的增加，Bcl-2 mRNA表达逐渐升高（P<0.05）。

2.4 Bax mRNA的表达

不同培养时间各组细胞Bax mRNA的表达见表3。

培养12 h时，实验1、2组较对照组Bax mRNA表达无统计学差异，实验3组Bax mRNA表达显著降低（P<0.05）；培养24、48 h时，4组之间均有统计学差异，随着KGF浓度的增加，Bax mRNA表达逐渐降低（P<0.05）。

3 讨论

KGF主要由间质细胞表达，以旁分泌形式作用于上皮细胞，特异性地刺激上皮细胞增生，而对间质细胞及其他细胞无此作用。近年来发现：KGF不仅可以促进上皮细胞的增殖和分化，并能抑制上皮细胞的凋亡过程[3-4]。在对肺癌的研究中发现，KGF通过调节Bcl-2来抑制细胞的凋亡[5]。一切抑制或促进凋亡的基因对细胞凋亡的影响，最终均归结为Bax与Bcl-2比值的改变[6]。细胞凋亡是Bcl-2蛋白与Bax蛋白共同作用的结果，Bax蛋白具有一个跨膜位点，Bcl-2的编码区含有与Bax蛋白高度同源的BH1和BH2结构域，在该区Bax可与Bcl-2形成异源二聚体或自身形成同源二聚体，是参与细胞凋亡的主要结构基础。死亡细胞激活Bax，使Bax由细胞浆转移到了线粒体膜上。当Bax过表达时，Bax在BH1和BH2结构域形成的同源二聚体增多，使Bcl-2受到了抑制，导致细胞凋亡增加；当Bcl-2过度表达时，其与Bax结合，异源二聚体增多，Bax受到抑制，导致细胞凋亡减少，因此Bcl-2与Bax的比例是细胞死亡的敏感性变阻器[7]。在人正常口腔黏膜中，KGF mRNA主要表达于间质的部分成纤维细胞，少量表达于血管内皮细胞，且主要表达于胞浆中，呈颗粒状，而在上皮细胞中无表达[8]。重组人角质细胞生长因子作用于KGF受体，可以产生与内源性KGF相同的生物学活性[9]。研究发现，未经治疗的口腔黏膜白斑（oral leukoplakia，OLK）组织中，基底膜上Bcl-2蛋白呈弱阳性表达，经维A酸治疗后，Bcl-2蛋白无表达。在采用双盲法治疗OLK的研究中，Piattelli等[10]发现局部使用维A酸后，患者的病损面积减小，口腔病损明显改善，且病损组织中基底层细胞中未检测到Bcl-2蛋白的表达。另外一项研究发现：Bax在OLK未恶变的组织中无高频率表达。Bcl-2家族在OLK的发生发展及治疗中发挥了重要作用。在大鼠辐射复合皮肤损伤模型[11]中，伤口周围注射携带KGF基因的减毒沙门氏菌SPK菌株后，炎症反应减轻，促进了血管新生和肉芽组织形成，提高了皮肤伤口愈合速率。

课题组前期研究发现，KGF mRNA及蛋白在正常口腔黏膜组、OLK组及口腔鳞癌组中的表达依次增加，且KGF在OLK上皮组织中的表达主要位于棘细胞层、颗粒层及不全角化层的上皮细胞中，而在基底细胞层的表达较弱；对OLK组织中Bcl-2蛋白的检测发现，其表达强于其在正常黏膜组织中的表达。综合以上研究结果，笔者推测，在口腔黏膜组织疾病的发生发展过程中，KGF是否通过调节凋亡相关基因Bcl-2、Bax的表达来调节上皮细胞的凋亡过程，从而在口腔黏膜病的发生及发展过程中发挥重要作用。因此，本实验采用外源性KGF作用于体外培养的口腔黏膜上皮细胞，观察不同浓度的KGF对培养的口腔黏膜上皮细胞的形态学影响，同时检测KGF对培养的上皮细胞凋亡率的改变及对凋亡相关基因Bcl-2、Bax mRNA表达水平的影响。研究发现：实验组较对照组细胞遮光性强，培养48 h时实验3组的细胞核仁明显；口腔黏膜上皮细胞的凋亡率随KGF浓度增加逐渐降低；KGF对凋亡相关基因Bcl-2、Bax mRNA的表达影响，在不同时间段、不同浓度时调控程度不同，12 h时实验3组Bcl-2 mRNA的表达开始上调；48 h时，KGF对Bcl-2、Bax mRNA的表达调控在各组均出现统计学差异，Bcl-2 mRNA随KGF浓度增加表达增强，Bax mRNA随KGF浓度增加表达降低。Bax表达降低，Bcl-2表达增加，使Bax与Bcl-2比值发生改变，异源二聚体增多，Bax受到抑制，从而抑制细胞凋亡。

本实验结果提示：KGF可以通过上调Bcl-2和下调Bax的表达，使Bax/Bcl-2比值发生改变，从而影响口腔黏膜上皮细胞的凋亡。

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（本文编辑 李彩）