单侧输尿管部分梗阻后输尿管平滑肌细胞中M3受体改变的实验研究

[摘要] 目的 测定大鼠单侧输尿管部分梗阻（PUUO）后输尿管平滑肌细胞中M3受体mRNA的转录水平和蛋白表达水平改变的规律，以探讨PUUO后输尿管平滑肌细胞中M3受体的作用。 方法 Wistar雄性大鼠80只，随机分为4组：8周PUUO组、16周PUUO组、8周对照组及16周对照组，每组各20只。两PUUO组（n = 40）采用把大鼠输尿管左侧上1/2段埋入腰大肌做成PUUO的大鼠模型，两对照组（n = 40）只游离左侧输尿管。模型制作成功后于8周和16周时取出输尿管，分别用RT-PCR检测输尿管平滑肌M3受体mRNA的含量，Western-blotting检测输尿管平滑肌M3受体蛋白的含量。 结果 RT-PCR结果示：M3受体mRNA的表达8周PUUO组高于8周对照组（55.16±3.94） vs （36.48±3.87），16周PUUO组低于16周对照组（19.37±3.70）vs（37.39±3.65），8周PUUO组高于16周PUUO组，差异均有统计学意义（均P < 0.05）。Western-blotting结果示：M3受体蛋白的表达8周PUUO组高于8周对照组（27.13±1.77）vs（21.36±2.69），16周PUUO组低于16周对照组（19.41±1.37）vs（23.43±1.58），差异均有统计学意义（均P < 0.05），8周对照组与16周对照组比较差异无统计学意义（P > 0.05）。 结论 梗阻8周时大鼠输尿管平滑肌中M3受体的生物合成上调，梗阻至16周时输尿管平滑肌中M3受体生物合成下调，为后续与临床相结合的研究做了更进一步的铺垫。

[关键词] 单侧输尿管部分梗阻；输尿管平滑肌；M3受体

[中图分类号] R693.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2012）10（b）-0034-03

已有研究显示，在单侧输尿管梗阻（PUUO）的动物模型中，8周时PUUO大鼠的输尿管肌条的收缩功能[1]和输尿管平滑肌细胞中的α1-肾上腺素能受体[2]以及Ca2+浓度均强于或者高于同期对照组，而16周时PUUO大鼠的相应指标均是减弱或者降低的。所以本研究采用国内学术界认可的输尿管梗阻动物模型制作方法，于不同实验时间点分离大鼠输尿管检测输尿管平滑肌M3受体蛋白的表达水平，为上尿路动力学研究同临床工作相结合做好铺垫。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组[3-4]

将80只190～230 g雄性Wistar大鼠随机分成4组：8周PUUO组、8周对照组、16周PUUO组和16周对照组，每组各20只。

1.2 大鼠输尿管梗阻模型的建立

两PUUO组大鼠用10%水合氯醛（0.4 mL/100 g）麻醉后仰卧位固定，腹部备皮后用络合碘消毒左侧腹部，行长3～5 cm的纵形切口。游离左侧输尿管，将腰大肌腹侧纵行切开1～2 cm，将左侧输尿管上1/2包埋于腰大肌切口中，用丝线缝合，注意切口不能过紧，造成部分输尿管梗阻模型。两对照组只将左侧输尿管游离，给与相同的刺激和生理环境。术毕在29℃恒温箱内使动物复苏，复苏后放回笼中，排便后在标准饮食和恒温照明条件下饲养，温度（21±2）℃，湿度（55±2）%[3]。

1.3 肾盂压力检测

参照文献[4]的方法进行模型验证。

1.4 主要试剂与仪器

高保真即用PCR扩增试剂盒（上海生工生物工程技术服务有限公司），Goat Anti-Mouse IgG（广州康世德生物有限公司），Western Blotting Kit兔IgG（广州康世德生物有限公司）。PE2400PCR扩增仪（Perkin-Emer公司），旭日EF-750生物电泳分析系统（广州旭日科技有限公司）。

1.5 实验方法

1.5.1 RT-PCR检测输尿管平滑肌M3受体mRNA表达水平

1.5.1.1 检材取样与RT-PCR 造模成功后，提取输尿管平滑肌细胞M3受体mRNA，取2 μg mRNA加入cDNA合成试剂盒配置成混悬液进行反转录。取总RNA模板2 μg、引物Oligo（dT）18（0.5 μg/μL）1 μL，用Px2′NTase-free水定容至12 μL，充分混合均匀，70℃恒温水浴5 min后加入5×Reaction Buffer 4 μL、Rnase Inhibitor（20 U/μL）1 μL、dNTP Mix（10 mmol/L）2 μL充分混匀，37℃恒温水浴5 min后加入1 μL M-MuLvRT（20 U/μL），使终体积为20 μL。37℃水浴保温60 min，70℃水浴加热10 min后结束反应，将所得cDNA于-20℃冻存。各引物序列参照Gen Bank中的序列，应用ABI primer express 3.0软件进行引物设计。

1.5.1.2 PCR扩增反应及电泳 按照高保真即用PCR扩增试剂盒说明书进行PCR扩增反应。抽取每种扩增产物15 μL，进行琼脂糖凝胶电泳分析，分别用DNA marker来判断扩增片段的大小，用溴化乙锭染色来观察所得扩增产物的量与片段大小。PCR扩增产物在100 V恒压1.6%的琼脂糖凝胶中电泳约90 min后，电泳的条带结果输入生物凝胶电泳图像分析系统进行图像分析，根据所得灰度值将参照引物的浓度与M3受体mRNA对比得出具体数值。

1.5.2 Western- blotting法检测输尿管平滑肌中M3受体蛋白水平

取梗阻以上肿胀的输尿管组织100 mg，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎，加入蛋白裂解液1 mL，冰上研磨5～10 min，重复3次。取匀浆1 000 mL，4℃下12 000 r/min离心5 min，取上清液加入等体积的2×SDS buffer，加热至100℃，5～10 min，迅速冰浴，取上层清液，置于-20℃保存备用。制备10 mm厚的SDS胶，包含0.1%十二烷基磺酸钠，其中分离胶含12%聚丙烯酰胺，积层胶含5%聚丙烯酰胺。计算出含25 μg蛋白的溶液体积后，蛋白样品电泳进行分离，浓缩胶电压80 V，30～60 min；分离胶电压120 V，2～3 h。然后经200 mA恒流电转膜至PVDF膜，用5%牛奶封闭液室温封闭PVDF膜3 h，与特异性M3受体抗体：Rabbit Anti CHRM3（广州康世德）1∶1 000稀释，4℃过夜。TBST洗涤，3×5 min，及相应二抗∶Western-blotting Kit兔IgG（广州康世德）1∶5 000稀释，室温反应2 h，以β-actin肌动蛋白作为内参对照。将PVDF膜置二氨基联苯胺（DAB）显色试剂中进行显色，并用生物凝胶电泳图像分析系统（旭日EF-750），对Western- blotting印迹条带进行图像采集照相和数据分析，测定其灰度值，并计算目的条带面积和灰度的乘积值与β-actin内参蛋白条带面积和灰度的乘积值的比值用于定量比较。

1.6 统计学方法

采用统计软件SPSS 15.0对实验数据进行分析，计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，采用方差分析，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

成模的40只大鼠通过验模后，8周PUUO组和8周对照组分别有17只和19只完成实验，16周PUUO组和16周对照组分别有14只和16只完成实验。

2.1 各组输尿管平滑肌中M3受体mRNA表达结果

RT-PCR结果显示M3受体mRNA的表达，8周PUUO组高于8周对照组（55.16±3.94）vs（36.48±3.87），16周PUUO组低于16周对照组（19.37±3.70）vs（37.39±3.65），8周PUUO组高于16周PUUO组，差异均有统计学意义（均P < 0.05）。见表1。

2.2 各组输尿管平滑肌中M3受体蛋白表达结果

Western-blotting结果显示M3受体蛋白的表达，8周PUUO组高于8周对照组（27.13±1.77）vs（21.36±2.69）（P < 0.05），16周PUUO组低于16周对照组（19.41±1.37）vs（23.43±1.58），差异均有统计学意义（均P < 0.05），8周对照组与16周对照组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表2。

3 讨论

泌尿系统是完整、统一的整体，在解剖结构上是具有连续性的管道，具有贮存、转运和排泄尿液的功能，而尿路梗阻是临床上常见的一种病变，不论其发生在泌尿系统的任何部位和任何性质，梗阻部位近端的尿路均会随病程的进展出现尿流储运异常，进而逐渐影响肾脏功能[5]。

近些年来，许多学者致力于上尿路梗阻后其受累器官肾脏发生改变的研究[6-7]，并且已经取得了一定的进展。而本研究则将尿路梗阻后最先发生变化的输尿管作为研究对象，观察病变早期受累组织输尿管的生理、生化的改变，揭示其相关机制所发生的变化。本研究已在前期证实了PUUO模型中病变输尿管的平滑肌收缩功能和平滑肌细胞中α1-肾上腺素能受体以及Ca2+浓度在不同梗阻时间点发生的相应变化，所以本研究期望通过分子水平的进一步探讨来阐明PUUO后输尿管发生的变化。

M3受体是人体平滑肌细胞中一种重要的G蛋白偶联受体，虽然在上段输尿管平滑肌细胞膜上分布不是最多的受体，但是它的兴奋可以加强输尿管平滑肌的收缩力，加快收缩频率。M3受体与配体结合后，即可通过一系列的生化反应增加细胞质内的Ca2+，使得平滑肌收缩。所以，M3受体在输尿管平滑肌的收缩中扮演着重要的角色，尤其是在输尿管发生梗阻后的整个病理变化过程中起着举足轻重的作用。

本研究在前期的系列研究中已经发现，在PUUO动物模型中8周实验组大鼠的输尿管平滑肌的收缩功能和输尿管平滑肌细胞中的α1-肾上腺素能受体以及Ca2+浓度均强于或者高于同期对照组，而16周实验组的相应指标均是减弱或者降低的。通过本实验，笔者发现在输尿管梗阻的动物模型中8周实验组病变输尿管平滑肌中M3受体mRNA及其受体的表达水平高于同期对照组（P ﹤ 0.05），16周实验组病变输尿管平滑肌M3受体mRNA及其受体的表达水平低于同期对照组（P ﹤ 0.05），而两同期对照组病变输尿管平滑肌中M3受体mRNA及其受体的表达水平差异无统计学意义（P ﹥ 0.05）。也就是说，8周实验组大鼠病变输尿管平滑肌中M3受体mRNA的表达及其受体的合成是上调的，而16周实验组大鼠病变输尿管平滑肌中M3受体mRNA的表达及其受体的合成则是下调的。由此，通过本实验在分子水平上可以证明大鼠发生尿路梗阻后8周处于代偿期而16周处于失代偿期，这也为发生尿路梗阻后输尿管产生的一系列病理、生化改变提供了实验依据。

在临床中，引起尿路梗阻的疾病有多种，临床表现各有不同，例如输尿管结石引起的肾绞痛可能是输尿管平滑肌处于代偿期而收缩功能增强所致[8]，所以笔者一般是应用M3受体的阻滞剂对其干预来降低输尿管平滑肌的兴奋从而解除痉挛，缓解患者的症状。而有的疾病例如肾盂输尿管连接部狭窄，由于早期无症状，当发现尿路梗阻时已经产生肾积水，输尿管平滑肌可能处于失代偿期，而无法促进梗阻部位以上尿液的排泄。因此根据本研究得出的结论，可以考虑通过选择合适的时间点使用相应的药物干预其发展的过程来缓解输尿管在发生梗阻的代偿期或者失代偿的前期产生的各种症状，达到解除患者痛苦，减轻或者延缓尿路梗阻对受累器官肾脏的损害。但是如何选择合适的时间点进行干预，选择何种方法干预，干预的结果又如何，还有待以后继续研究和探讨，以便得出进一步的结果。

[参考文献]

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[4] Wen JG，Chen Y，Frokiaer J，et al. Experimental partial unilateral ureter obstruction（Ⅰ）：pressure flow relaltionship in rat model with mild and sever acute ureter obstruction [J]. J Urol，1998，160（4）：1567-1571.

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（收稿日期：2012-05-11 本文编辑：李继翔）