脐橙根际拮抗细菌的筛选与初步鉴定

摘 要:对脐橙根际土壤细菌进行分离,得到116个土壤分离物。通过对峙试验筛选,共选出16个细菌分离物对炭疽病病原菌有良好的拮抗效果,并对其进行了初步鉴定。根据分离物的理化性质并结合《常见细菌系统鉴定手册》,将QC38、QC61、QC63、QC68四株菌初步鉴定为芽孢杆菌属(Bacillus);将QC8、QC79、QC83三株菌初步鉴定为黄色杆菌属(Xanthobacter);将QC13、QC14、QC30、QC35、QC47、QC87、QC123、QC124、QC129九株菌初步鉴定为假单胞菌属(Pseudomonas)。

关键词:脐橙; 炭疽病; 拮抗; 对峙试验

中图分类号:S154.38+1 文献标识号:A 文章编号:1001-4942(2010)03-0064-04

脐橙是一种重要的经济作物,而其炭疽病(Colletotrichum gloeosporioides Penz.)[1]发生日趋严重,发病严重时引起大量落叶,枝梢枯死,僵果和枯蒂落果,枝干开裂,导致树势衰退,产量下降,甚至整枝整株枯死[2],不但降低品质,而且影响其经济价值。化学防治虽防效可观,但对环境的污染、潜在的安全性以及病原物抗性的产生都不容忽视[3]。在环保、安全、持续成为发展方向的今天,生物防治是进行植病防治的首选措施之一,前人的成功经验也说明,从自然界中分离、筛选拮抗菌防治脐橙炭疽病病害是完全可行的[4,5]。本试验从脐橙炭疽病病区采集的脐橙根际土壤中分离细菌,通过对峙试验筛选出对炭疽病病原菌具有良好拮抗效果的细菌,并对其进行了初步鉴定。

1 材料与方法

1.1 脐橙根际样品

脐橙根际土壤,采自福建脐橙种植区。

1.2 菌株

炭疽病病原菌(Colletotrichum gloeosporioides Penz.),由本实验室保存。

1.3 主要培养基

(1) PDA培养基:培养炭疽病病原菌和进行拮抗试验。

(2) LB培养基:分离根际细菌,保存与活化菌种。

1.4 脐橙根际细菌的分离

称取1 g脐橙根际土壤,放入盛有100 ml无菌水和数粒玻璃珠的三角瓶中,振摇20 min ,使之充分混匀。取1 ml上述悬浮液加入盛有9 ml无菌水的试管中,制备10-1浓度的悬浮液,同样方法依次制备10-2、10-3、10-4、10-5、10-6浓度的悬浮液。用微量移液器依次分别吸取不同浓度悬浮液 0.1 ml加入至LB固体培养基平板上,均匀涂布,37℃培养 24 h,将培养后长出的单个菌落分别用灭菌牙签挑取少许细胞接种到LB培养基平板上,37℃培养 [6,7] 。待菌苔长出后,检查其特征是否一致,同时将细胞涂片染色后用显微镜检查是否为单一的微生物,若发现有杂菌,需再一次进行分离、纯化,直到获得纯培养。

1.5 拮抗菌的筛选将炭疽病病原菌用接种铲接种于PDA平板的中央位置,于28℃恒温培养2 d,待其长成直径约为2 cm的菌落后,再将活化好的土壤分离物分别通过划线接种法接种到培养基上,距离病原菌菌落约2 cm(见图1),每个培养基接种3个细菌分离物,l d后检查对峙培养结果,根据病原菌与土壤分离物菌落扩展的速度、菌落之间有无抑制带、菌落边缘是否出现稀疏和萎缩现象等来判断该土壤分离物对病原菌有无拮抗作用。其中,两菌落之间有明显的抑制带即认为该分离物对炭疽病病原菌的生长与繁殖具有明显抑制作用[8]。多次重复对峙试验,验证其拮抗效果的稳定性,将具有稳定拮抗效果的分离物于4℃冰箱保存备用。

1.6 分离物鉴定

1.6.1 形态学特征 对拮抗效果良好的细菌划线接种于LB培养基上,待长出菌落后对其菌落特征进行观察并记录。

1.6.2 生理生化特性 对所筛选出的拮抗菌进行生理生化鉴定:过氧化氢酶试验(接触酶),明胶液化试验,淀粉水解试验,柠檬酸盐利用试验,葡萄糖氧化发酵试验,甲基红(MR)试验,V-P试验,硝酸盐还原试`验,吲哚产生试验,产H2S试验,脲酶试验,脂酶(Tween80)试验,牛奶分解试验等参照文献[6,9]的方法进行。

2 结果与分析

2.1 脐橙炭疽病拮抗细菌的筛选

利用稀释平板法分离得到116个土壤分离物,经过对峙试验筛选, 16个菌株表现有良好的拮抗效果,分别是 QC8、QC13、QC14、QC30、QC35、QC38、QC47、QC61、QC63、QC68、QC79、QC83、QC87、QC123、QC124和QC129,其部分菌株的拮抗效果如图1所示。

2.2 形态学观察

革兰氏染色结果表明,QC38、QC61、QC63、QC68为革兰氏阳性菌,其它12株菌皆为革兰氏阴性菌,16株拮抗菌单菌落形态描述见表1。

2.3 生理生化特性

根据菌株的生理生化鉴定结果(表2、表3)并结合《常见细菌系统鉴定手册》[9],可以将QC38、QC61、QC63、QC68四株菌初步鉴定为芽孢杆菌属(Bacillus),将QC8、QC79、QC83三株菌初步鉴定为黄色杆菌属(Xanthobacter);将QC13、QC14、QC30、QC35、QC47、QC87、QC123、QC124、QC129九株菌初步鉴定为假单胞菌属(Pseudomonas)。

3 讨论

中国是一个农业大国,每年病虫害发生面积(2.0～2.6)×108 hm2,农药用量达10×104 t。目前我国的农药结构极不合理,基本上以化学农药占主导。其中,高毒、高残留、对环境影响大的农药用量占半数以上,开发新型生物农药是减少化学农药用量的有效途径之一,也符合发展绿色生态农业的要求。炭疽病是农作物的主要病害之一,如何高效、安全、可靠的进行炭疽病的防治是长期以来亟待解决的难题[10]。我国炭疽病防治研究已经取得了很大的进展,不论农业防治、生物防治还是化学防治都取得了很好的成绩,从罹病植株根际土壤或罹病植株本身获得具有高效拮抗能力的菌株成为炭疽病拮抗菌筛选研究的主要方向。

本试验通过对脐橙根际土壤细菌进行分离、筛选与鉴定,根据《常见细菌系统鉴定手册》[9],将QC38、QC61、QC63、QC68四株菌初步鉴定为芽孢杆菌属(Bacillus);将QC8、QC79、QC83三株初步鉴定为黄色杆菌属(Xanthobacter);将QC13、QC14、QC30、QC35、QC47、QC87、QC123、QC124、QC129九株菌初步鉴定为假单胞菌属(Pseudomonas)。分离菌株与模式菌株在部分生理生化反应中存在一定差异,例如QC8的淀粉水解、柠檬酸盐、脲酶、乳糖发酵等试验的结果与模式菌株Xanthobacter不同,可能是菌株之间的差异。确切地鉴定结果需要结合菌株的16S rDNA序列分析或DNA序列同源性分析等得出结论。

参 考 文 献:

[1] 段志坤.柑橘炭疽病及其防治对策[J].绿色植保,2009,6-7.

[2] 王 博.柑橘炭疽病发生成因及防治对策[J].植物医生,2008,21(4):9-10.

[3] Gottwald T R,Graham J H.A device for precise and nondisruptive stomatal inoculation of leaf tissue with bacterial pathogens[J]. Phytopathology, 1992,82: 930-935.

[4] 于淑池,张利平,王立安.拮抗细菌作为生物防治手段研究进展[J].河北农业科学,2004, 8(1):62-65.

[5] 闫孟红.具有生物防治作用的辣椒内生细菌及根面细菌的分离、筛选和初步鉴定[D].北京:首都师范大学,2004.

[6] 周德庆. 微生物学实验手册[M]. 上海: 上海科学技术出版社,1986,121-123.

[7] 唐 亮,张进忠,于萍萍,等.硅酸盐细菌的分离、纯化、鉴定及生物学特性研究[J]. 山东农业科学,2008,1:71-73.

[8] 杨秀荣,刘水芳,孙淑琴,等. 生防细菌B579的分离筛选及鉴定[J].山东农业科学,2008,3:91-94.

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[10]Marull J,Pinochet J,Rodrigue Z K R.Agricultural and municipal compost residues for control of root-knot nematodes in tomato and pepper[J].Compost Science and Utilization,1997,5(1):91-94.