拉萨地区产ESBLs大肠埃希菌检测及基因型分析

摘要：目的 了解拉萨地区大肠埃希菌临床分离菌株产ESBLs情况及其主要基因型分布。方法 参照2009年CLSI推荐方法对拉萨市临床医院细菌感染性疾病临床标本中分离所获56株大肠埃希菌进行ESBLs表型检测及确证，采用PCR扩增法检测TEM、SHV、CTX-M型ESBLs基因在试验菌株中的分布。结果 56株大肠埃希菌临床菌株中共检出产ESBLs菌株22株，检出率为39.29%；PCR扩增分析显示TEM、SHV、CTX-M型ESBLs基因检出率分别为40.91%、27.27%、4.55%。结论 拉萨地区产ESBLs大肠埃希菌检出率略低于国内其他地区，ESBLs基因型以TEM型和SHV型为主。

关键词：拉萨；大肠埃希菌；ESBLs

自20世纪40年代以来，随着各类抗生素的研制和广泛使用，细菌的耐药性也广泛出现。目前，细菌耐药已成为一个全球性的公共卫生问题。大肠埃希菌是临床细菌性感染的常见病原菌，占临床细菌感染标本总检出构成比的18，3%，居首位[1]，其抗生素耐药的重要机制之一为超广谱β-内酰胺酶（extended spectrumβ-lactamases，ESBLs）的产生。ESBLs是指由质粒介导的能赋予病原菌对头孢菌素类（如头孢噻肟、头孢三嗪和头孢他啶等）和单酰胺酶类抗生素、氨曲南以及青霉素耐药的一类β-内酰胺酶，主要分为五类：TEM型、SHV型、CTX-M型、OXA型及其他型，其中TEM、SHV、CTX-M型最为常见，不同地区ESBLs基因分布类型不尽相同[2]。为了解拉萨地区临床大肠埃希菌产ESBLs及其主要基因型分布情况，本研究对拉萨市2010～2012年三家临床医院细菌感染性疾病临床标本中分离所获的56株大肠埃希菌进行了ESBLs表型检测，并对其ESBLs基因型进行分析，现将结果报告如下。

1资料与方法

1.1菌株 本院病原生物学实验室2010～2012年自西藏自治区第二人民医院、拉萨市人民医院及妇幼保健院细菌感染性疾病临床标本（类型包括：痰液、尿液、化脓性伤口分泌物、脓肿液、血液等）中分离所获大肠埃希菌56株，菌种鉴定及药物敏感性试验质控菌株ATCC25922，购自卫生部临床微生物检验中心，本院病原生物学实验室保存。

1.2主要材料及仪器 药敏纸片、MH琼脂购自英国Oxoid公司，在有效期内使用。细菌基因组DNA提取试剂盒、2×Taq Plus PCR MasterMix、DNA Marker、Goldview、琼脂糖为北京天根生物产品。ATB Expression 菌种鉴定仪（法国生物梅里埃），PCR扩增仪及电泳凝胶成像系统（美国BIORAD公司）。

1.3菌种鉴定和药敏试验 采用ATB Expression 菌种鉴定仪对试验菌株进行鉴定，56株试验菌株均为大肠埃希菌。参照2009年美国临床实验室标准化协会（CLSI）推荐的Kirby-Bauer纸片扩散法进行抗菌药物敏感性试验及双纸片扩散法进行表型确证。CAZ和CAZ/CLA及CTX 和CTX/CLA两组纸片中任何一种纸片抑菌圈直径比相应不含克拉维酸纸片抑菌圈直径≥5mm，则判定为产ESBLs菌株。

1.4耐药基因检测

1.4.1模板DNA的制备 取适量产酶菌株普通琼脂平板过夜培养菌落混悬于5ml无菌 0.9%NaCl溶液中，12000rpm离心5min弃上清，其后步骤按照细菌基因组DNA提取试剂盒操作说明书进行。制备之基因组DNA -80℃存放备用。

1.4.2 PCR引物及PCR反应 根据Genebank报道的各型ESBLs基因序列设计TEM、SHV及CTX-M基因扩增引物，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，引物序列及扩增预期片段大小见表1。反应体系25μl，包括2×Taq Plus PCR MasterMix 15μl，上下游引物各1.5μl，模板DNA 2μl，去离子水5μl。各基因PCR扩增条件：95℃预变性5min，95℃变性1min，退火30s（TEM、SHV及CTX-M基因退火温度分别为56℃、52℃及56℃），72℃延伸1min，40个循环，末次循环72℃延伸5min，反应结束后4℃放置。

1.4.3琼脂糖凝胶电泳 1%琼脂糖凝胶电泳检测各ESBLs基因PCR扩增产物，凝胶成像仪拍照并进行分析。

2结果

2.1 ESBLs检出率 共检测大肠埃希菌56株，检出产ESBLs菌株22株，占39.29%。其中CAZ、CAZ/CLA组，CTX、CTX/CLA组检出率分别为35.71%（20/56）和33.93%（19/56），两组均检出者有17株。

2.2 PCR扩增结果及基因型分布 部分产ESBLs菌株TEM、SHV、CTX-M基因PCR扩增产物1%琼脂糖凝胶电泳结果见图1。扩增所获片段大小与设计一致。22株产ESBLs大肠埃希菌中TEM型阳性9株，SHV型阳性6株，CTX-M型阳性1株，TEM+SHV型阳性4株，所占产ESBLs菌株比例分别为40.91%（9/22）、27.27%（6/22）、4.55%（1/22）和33.33%（4/22）。

3讨论

随着第三代头孢菌素的广泛使用，产ESBLs菌株检出率也在不断地增多。ESBLs主要由肠杆菌科细菌产生，尤以大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌最为多见。产ESBLs大肠埃希菌株和肺炎克雷伯菌株不仅对第一、二、三代头孢菌素耐药， 而且对氨基糖苷类、喹诺酮类、磺胺类等交叉耐药。目前，产ESBL 菌株引起的耐药已经成为全球最重要的医院内耐药问题之一，给临床治疗和预防带来了巨大的挑战。

本研究共检测临床分离大肠埃希菌菌株56株，产ESBLs阳性22株，产ESBLs检出率为39.29%。其表型确证实验结果显示，以CAZ、CAZ/CLA组检出模式阳性率最高，占35.71%；两组均阳性者占30.36%。该结果较国内其他地区50%～70%的大肠埃希菌产ESBLs检出率低[3]。抗菌药物的大量使用是细菌形成耐药性甚至多重耐药的重要诱因，不同地区及医院使用三代头孢菌素类的种类、数量及时间等不尽相同，临床菌株的耐药表型亦会存在差异。由于西藏地处祖国边陲，三代头孢菌素使用相对较少且品种较为单一，这可能是导致拉萨地区临床大肠埃希菌产ESBLs检出率低于国内其他地区的主要原因。

ESBLs基因型分布结果显示，22株ESBLs表型确证阳性的菌株中TEM型和SHV型分别占40.91%和27.27%，为拉萨地区临床产ESBLs大肠埃希菌的主要基因型，CTX-M型仅检出一株占4.55%（1/22）。产ESBLs的细菌呈世界性分布，但由于不同地区药物使用不同等原因，其流行基因型也不尽相同。文献报道在北美地区流行的主要基因型是TEM和SHV型[4]。日本主要是Toho-2组和CTX-M型酶。我国宁夏、广州等地大肠埃希菌ESBLs基因主要为SHV和TEM型[5]，也有主要为CTX-M型的报道[6]，我们的检测结果显示拉萨地区临床大肠埃希菌ESBLs的主要流行型别为TEM和SHV型。另外，由于ESBLs基因种类众多，在我们所检测的22株菌株中TEM、SHV及CTX-M型别均为阴性的6株菌株可能为其他型别，具体的基因种类需进一步研究确定。

本研究所使用菌株数量相对较少，来源也仅局限于拉萨市的三家临床医院，故尚不能够全面反映出拉萨地区临床大肠埃希菌株产ESBLs情况，但该研究对拉萨地区临床医师合理使用抗生素，控制耐药菌株的形成及蔓延仍具有一定的实践意义。

参考文献：

[1]肖永红，沈萍，魏泽庆，等.Mohnarin 2011年度全国细菌耐药监测[J].中华医院感染学杂志，2012，22（22）：4946-4952.

[2]Shah A A， Hasan F， Ahmed S， et al. Characteristics， epidemiology and clinical importance of emerging strains of Gram negative bacilli producing extended spectrum beta-lactamase [J]. ResMicrobiol， 2004，155（6）：409-421.

[3]张永标，张扣兴，唐英春，等.产质粒介导AmpC酶和ESBLs细菌的耐药性及β-内酰胺酶基因型研究[J].中华微生物学和免疫学杂志， 2004，24（7）：577-582.

[4]Minarini L A， GalesA C， Palazzo IC， et al. Prevalence of community occurring extended spectrum beta-lactamase producing Enterobacteriaceae in Brazil[J]. CurrMicrobiol，2007，54（5）：335-341.

[5]肖庆忠，苏丹虹，江洁华，等.广州地区3500株革兰阴性杆菌TEM和SHV产超广谱β-内酰胺酶基因分型研究[J].中华检验医学杂志，2005，28：1010-1014.

[6]杜军，李敏，崔景荣，等.产超广谱β-内酰胺酶大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌耐药性及基因型研究[J].中国抗生素杂志，2009，34（8）：512-515.

编辑/申磊