黄连解毒汤中三种成分在大鼠体内的药代动力学研究

[摘要] 目的：研究黄连解毒汤中盐酸小檗碱、黄芩苷、栀子苷在大鼠体内的药代动力学。方法：健康大鼠灌胃给予黄连解毒汤，收集不同时间的含药血浆，采用HPLC法测定大鼠血浆中盐酸小檗碱、黄芩苷、栀子苷三种成分的血药浓度，运用3P97药代动力学软件拟合房室模型，计算其药动学参数。结果：黄连解毒汤中盐酸小檗碱和黄芩苷在大鼠血浆中的药-时过程属于一室开放模型，栀子苷在大鼠血浆中的药-时过程属于二室开放模型。结论：建立了HPLC法测定黄连解毒汤中三种成分血药浓度的方法，为黄连解毒汤的合理用药提供了药代动力学数据，同时也为中药复方的药代动力学研究提供了可借鉴的方法。

[关键词] 黄连解毒汤；盐酸小檗碱；黄芩苷；栀子苷；药代动力学

[中图分类号] R285.5[文献标识码]A [文章编号]1673-7210（2008）01（c）-013-04

Pharmacokinetics of three components in Huanglianjiedu Decoction in rats

XIAO Xue-feng 1, QIAO Xiao-li 1, GAO Lan1, ZHANG Jun-ping2, DU Wu-xun3, SUN Yu1,LI Cun-yu1

(1.Tianjin University of TCM, Tianjin 300193, China; 2.The First Affiliated Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin300193, China; 3.The Second Affiliated Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 300150, China)

[Abstract]Objective:To study the phamacokinetics of three components(berberine hydrochloride, baicalin, jasminodin) in Huanglianjiedu Decoction in rats plasma.Methods: After the rats were administered by Huanglianjiedu Decoction through ig, HPLC was used to determine the three components(berberine hydrochloride, baicalin, jasminodin) in blood plasma at different times, 3P97 procedure was used to process concentration-time data.Results:The whole blood concentration-time course of Berberine hydrochloride and baicalin after oral administration Huanglianjiedu Decoction was fitted to be a one-compartment model, and the same course of jasminodin was fitted to be a two-compartment model. Conclusion:This essay establishes a method for determine three components in Huanglianjiedu Decoction in rats plasma, provided the pharmacokinetic parameters for rational administration of Huanglianjiedu Decoction, and also provided the pharmacokinetic study method of compounds.

[Key words] Huanglianjiedu Decoction; Berberine hydrochloride; baicalin; jasminodin; pharmacokinetics

黄连解毒汤出自《外台秘要》，由黄连、黄芩、黄柏、栀子组成，具有抑菌、降压作用[1]，其中主要成分有三大类：生物碱类（黄连、黄柏），黄酮类（黄芩），环烯醚萜类（栀子）[2]。近年来随着药动学研究的兴起，对于单味药的药动学分析研究较多[3~5]，但同时研究复方中多成分的药动学几乎未见报道。我们采用HPLC法，在不同色谱条件下检测黄连解毒汤中三种成分的血浆药物浓度，以说明其在大鼠体内的吸收过程，从而为黄连解毒汤的合理用药提供理论及临床依据。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1试药盐酸小檗碱对照品、黄芩苷对照品、栀子苷对照品、内标物芦丁、内标物补骨脂素均购自中国药品生物制品检定所；甲醇、乙腈、四氢呋喃、三乙胺均为色谱纯，磷酸为分析纯，色谱分析用水为娃哈哈饮用纯净水。

1.1.2 仪器Waters515系列高效液相色谱仪(515 HPLC pump,2487 Dual λ Absorbance Detecter)；LG10－2.4A型高速离心机（北京医用离心机厂）；N-EVAPTM111氮吹仪(Organomation Associates, Jnc. 266 River Road West Berlin,MA01503.U.S.A.)；XW－80A微型旋涡混合仪(上海沪西分析仪器厂)。

1.2 实验动物

SD大鼠，体重270 g左右，雄性，中国医学科学院放射医学研究所实验动物中心提供，清洁级，合格证号：SCXK津2005-0001。

1.3实验方法

1.3.1 对照品、内标溶液的制备用甲醇配制浓度为0.7 μg/ml的盐酸小檗碱对照品溶液；浓度为0.022 mg/ml的黄芩苷标准品溶液；浓度为0.01 mg/ml的栀子苷对照品溶液；浓度为0.058 mg/ml的补骨脂素内标液；浓度为0.096 mg/ml的芦丁内标液。

1.3.2 实验用药品的制备黄连、黄柏、黄芩、栀子均购自天津中新药业。精密称取黄连9 g、黄芩6 g、黄柏6 g、栀子9 g，加8倍量水浸泡2 h，武火煮沸后文火煎煮40 min，取一煎液，再加6倍量水煎煮30 min后取二煎液，二液合并后浓缩成含生药2 g/ml。

1.3.3 药代动力学实验健康大鼠12只，随机分为6组，每组2只，按4 g/100 g的剂量灌胃给予黄连解毒汤（给药前禁食不禁水12 h），给药后于10，30，60，90，120，150，180，210， 240，360，480，600，1 080 min分别眼底取血0.5 ml于肝素化试管，6 000 rpm离心15 min，取血浆100 μl，分别加入补骨脂素内标液0.5 ml，芦丁内标液0.5 ml，再加入1 mol/L磷酸二氢钾溶液50 μl，于微型旋涡混合仪混合30 s，6 000 rpm离心，吸取上清液800 μl，45℃以下氮气吹干，以50 μl甲醇复溶，旋涡混匀，离心，取上清液分别于相应色谱条件下进样。采用中国药理学会数学药理委员会编制的3P97实用药代动力学软件处理血药浓度数据，分别按一室、二室、三室模型进行模拟，并求得其药动学参数。

1.3.4 色谱条件选用CenturySIL BDS C18柱（250 nm×4.6 nm，5 μm），不同流动相和检测波长对3种成分进行分离，具体条件见表1。

1.3.5 血浆样品预处理实验大鼠眼底取血至肝素化试管中，离心后得空白血浆。取空白血浆，加入内标液/甲醇液1 ml（盐酸小檗碱加补骨脂素内标液1 ml；黄芩苷加芦丁内标液1 ml；栀子苷加甲醇液1 ml），再加入1 mol/L磷酸二氢钾溶液50 μl，于微型旋涡混合仪混合30 s，6 000 rpm离心，吸取上清液800 μl，45℃以下氮气吹干，以50 μl甲醇复溶，旋涡混匀，离心，取上清液20 μl进样。

2结果

2.1 标准曲线的制备

分别配制盐酸小檗碱浓度为0.497，0.994，4.970，9.940， 14.480，29.960 μg/ml的系列血浆，按“血浆样品预处理”方法处理样品，在相应色谱条件下进样，以盐酸小檗碱与补骨脂素峰面积比（Y）对盐酸小檗碱浓度（X）作线性回归；配制黄芩苷浓度为30.14，49.94，99.00，149.60、198.00、253.00 μg/ml的系列血浆，按“血浆样品预处理”方法处理样品，在相应色谱条件下进样，以黄芩苷与芦丁峰面积比（Y）对黄芩苷浓度（X）作线性回归；配制栀子苷浓度为1，5，15，20，25，40 μg/ml的系列血浆，按“血浆样品预处理”方法处理样品，在相应色谱条件下进样，以栀子苷峰面积（Y）对栀子苷浓度（X）作线性回归。回归方程及线性范围见表2。

2.2 精密度和准确度实验

分别配制盐酸小檗碱浓度为0.994，9.940，29.960 μg/ml的系列血浆；配制黄芩苷浓度为49.94，149.60，253.00 μg/ml的系列血浆；配制栀子苷浓度为5，20，40 μg/ml的系列血浆，按“血浆样品预处理”方法处理样品，在相应色谱条件下进样。同一浓度每隔1 h测定1次，测3次，计算日内精密度；每隔1 d测定1次，测3 d，计算日间精密度；按照对照品测得量和投入量之比计算回收率。

盐酸小檗碱低、中、高3个浓度的日内精密度分别为6.11%， 6.04%，5.27%；日间精密度分别为6.25%，5.44%，5.04%。其回收率分别为低浓度（85.98±5.25）%，RSD 6.11%；中浓度(87.81±5.31)%，RSD 6.04%；高浓度(91.08±4.80)%，RSD 5.27%（n=5）。

黄芩苷低、中、高3个浓度的日内精密度分别为4.72%，5.52%，2.15%，日间精密度分别为6.04%，5.64%，3.65%，其回收率分别为低浓度(95.25±4.50)%，RSD 4.72%；中浓度(93.54±5.16)%，RSD 5.52%；高浓度(96.58±2.07)%，RSD 2.14%（n=5）。

栀子苷低、中、高3个浓度的日内精密度分别为3.92%，3.14%，2.86%，日间精密度分别为3.63%，4.17%，2.94%，其回收率分别为低浓度(87.50±1.21)%，RSD 1.38 %；中浓度(88.09±3.70)%，RSD 4.20 %；高浓度(87.26±2.50)%，RSD 2.86%（n=5）。

2.3 提取回收率

分别配制盐酸小檗碱浓度为0.994，9.940，29.960 μg/ml的系列血浆，按“血浆样品预处理”方法处理样品，在相应色谱条件下进样，记录盐酸小檗碱的峰面积。另取同样浓度的盐酸小檗碱对照品各5份于试管中，不加空白血浆，并加入补骨脂素内标液1 ml，再加入1 mol/L磷酸二氢钾溶液50 μl，于微型旋涡混合仪混合30 s，6 000 rpm离心，吸取上清液800 μl，45℃以下氮气吹干，以50 μl甲醇复溶，旋涡混匀，离心，取上清液在相应色谱条件下进样，记录盐酸小檗碱峰面积,计算以上两者峰面积比，即得盐酸小檗碱的提取回收率。盐酸小檗碱的平均提取回收率分别为低浓度(85.02±5.74)%，RSD 6.75%；中浓度(94.96±4.58)%，RSD 4.82%；高浓度(95.43±1.74)%，RSD 1.82%（n=5）。

配制黄芩苷浓度为49.94，149.60，253.00 μg/ml的系列血浆，按“血浆样品预处理”方法处理样品，在相应色谱条件下进样，记录黄芩苷的峰面积。另取同样浓度的黄芩苷对照品各2份于试管中，不加空白血浆，并加入芦丁内标液1 ml，再加入1 mol/L磷酸二氢钾溶液50 μl，于微型旋涡混合仪混合30 s，6 000 rpm离心，吸取上清液800 μl，45℃以下氮气吹干，以50 μl甲醇复溶，旋涡混匀，离心，取上清液在在相应色谱条件下进样，记录黄芩苷峰面积。计算以上两者峰面积比，即得黄芩苷提取回收率。黄芩苷的平均提取回收率分别为低浓度(86.16±7.74)%，RSD8.98%；中浓度(97.96±5.92)%，RSD 6.04%；高浓度(92.97±3.58)%，RSD 3.85%（n=5）。

配制栀子苷浓度为5，20，40 μg/ml的系列血浆，按“血浆样品预处理”方法处理样品，在相应色谱条件下进样，记录栀子苷的峰面积。另取同样浓度的栀子苷标准品各5份于试管中，不加空白血浆，并加入甲醇液1 ml，再加入1mol/L磷酸二氢钾溶液50 μl，于微型旋涡混合仪混合30 s，6 000 rpm离心，吸取上清液800 μl，45℃以下氮气吹干，以50 μl甲醇复溶，旋涡混匀，离心，取上清液在相应色谱条件下进样，记录栀子苷峰面积。计算以上两者峰面积比，即得栀子苷提取回收率。栀子苷的平均提取回收率分别为低浓度(84.81±10.60)%，RSD 12.50%；中浓度(87.53±5.42)%，RSD 6.19%；高浓度(90.31±3.72)%，RSD 4.12%（n=5）。

2.4 样品稳定性

分别配制盐酸小檗碱浓度为9.940 μg/ml的系列血浆，黄芩苷浓度为149.60 μg/ml的系列血浆，栀子苷浓度为20 μg/ml的系列血浆，按“血浆样品预处理”方法处理样品，将所配药液于冰箱中冷藏，分别于0，1，2，4，6，8，10，24，48，72 h在相应色谱条件下进样，以对照品测得量计算相对标准偏差。盐酸小檗碱样品在72 h内的RSD 9.06%（n=5）；黄芩苷样品在72 h内的RSD 7.80%（n=5）；栀子苷样品在72 h内的RSD 8.11%（n=5）。

2.5 黄连解毒汤中三种成分在大鼠体内的药动学研究

健康大鼠灌胃给予黄连解毒汤后，血浆中3种成分随时间变化的情况如图1所示。采用3P97实用药代动力学软件处理血药浓度数据，分别按一室、二室、三室模型进行模拟，获得AIC值和相关系数r。根据AIC值最小和r值最大原则，判定黄连解毒汤中盐酸小檗碱在大鼠体内的药-时过程符合一室开放模型(权重参数为1/C2)；黄芩苷符合一室开放模型(权重参数为1/C2)；栀子苷符合二室开放模型(权重参数为1/C2)。并求得其药动学参数，结果见表3。

3讨论

黄连解毒汤有效部位中含有总生物碱、总黄酮和有效成分盐酸小檗碱、黄芩苷、栀子苷等，这些有效成分的含量指标，可用来有效控制黄连解毒汤的内在质量。其中盐酸小檗碱是黄连和黄柏的主要有效成分之一，黄芩苷是从黄芩中提取出来的黄酮类有效成分，栀子苷是栀子化学成分中一种重要的环烯醚萜类化合物。本实验采用盐酸小檗碱、黄芩苷和栀子苷三个有效成分定量黄连解毒汤的药动学研究，定量成分数量多，而且均为有效成分，是中药复方药动学研究领域的一个突破，也为其他复方药动学研究树立了典范。

本实验盐酸小檗碱在大鼠体内的药动学过程符合一室开放模型，其药动学参数T（peak)约为119 min，与文献报道相符[3]。在大鼠体内盐酸小檗碱的代谢均出现了双峰现象,引起血药浓度回升的原因可能是药物在体内存在肠肝循环或其他循环过程（胃-肠循环、肠-肠循环）或者是存在多部分吸收所致，但上述推断仍需实验证实。

文献报道黄芩苷在体内过程较为复杂，口服后经胃肠道吸收缓慢，1 h左右才在血液中被发现，主要经肠道菌丛和肝微粒体转化成黄芩素，后者在空肠段快速吸收入血，并重新转化为黄芩苷[6]，于5 h左右达到血药最高峰[7]，且存在较明显的首过效应。黄芩苷在体内分布速度较快，分布相半衰期仅为数十分钟，表观分布容积为2.53 L/kg，说明黄芩苷与血浆和组织蛋白质结合力较高[8]。从黄连解毒汤中黄芩苷在大鼠体内的药代动力学参数可以看出, 黄芩苷在体内吸收较快，Ka为0.012/min-1，与文献报道的大略有相同[9]，t1/2Ka为1.04 h，而消除相较慢，Ke为0.0071/min-1，t1/2Ke 为7.12 h，这些结果与文献报道的代谢规律基本相符[10，11]，说明黄芩苷在体内的代谢基本上不受黄连解毒汤中其他成分的影响。

大鼠灌胃给予黄连解毒汤后，从黄连解毒汤中栀子苷的药动学参数可知：t1/2ka=31.10 min，t1/2α=79.02 min，t1/2β=13 031.81 min，提示黄连解毒汤中栀子苷在体内吸收、分布较快，消除较慢。

本实验结果为黄连解毒汤的临床合理用药、提高疗效提供了实验数据，对进一步的临床药理研究和药代药效结合研究提供参考。

[参考文献]

[1]陈光亮,张秀荣,王钦茂.黄连解毒汤药理研究进展[J].安徽中医学院学报,2001,20(5):67-69.

[2]任玲玲,薛兴亚.黄连解毒汤高效液相色谱分析方法的建立[J].世界科学技术-中医药现代化,2005,7(5):41-44.

[3]丁志平,林力.不同粒径黄连粉在大鼠体内药代动力学的研究[J].中医药学刊,2004,22(5):835-836.

[4]何心,石跃辉.黄芩苷在大鼠体内的药物动力学研究[J].中国药学杂志,1998,33(4):232-234.

[5]陈燕军,周爱香.黄芩清肺分散片中栀子苷的家犬药动学研究[J].中国中药杂志,2003,28(5):468-470.

[6]AkaoT,Kawabata K,Yanagisawa E,et al. Baicalin,the predominant flavone glucuronide of scutellariae radix,is absorbed from the rat gastrointestinal tract as the aglycone and restored to its original form[J].J Pharm Pharmacol,2000,52(12): 1563-1568.

[7]Muto R,Motozuka T,Nakano M,et al. The chemical structure of new substance as the metabolite of baicalin and time profiles for the plasma concentration after oral administration of sho-saiko-to in human[J].Yakugaku Zasshi,1998,118(3):79-87.

[8]何心,石跃辉,石春伟, 等.黄芩苷在大鼠体内的药物动力学研究[J].中国药学杂志,1998,33(4):232.

[9]王雪峰,刘芳,王永梅.小柴胡汤中黄芩苷在大鼠体内的代谢动力学研究[J].中药新药与临床药理,2001,12(2):84-87.

[10]毛凤斐.黄芩苷人体内吸收研究[J].中成药研究,1981,12:6.

[11]张志荣,胡晓颖,蒋大义，等.银黄冲剂中黄芩苷在家兔体内的代谢动力学研究[J].中成药, 1996,18(6):1.

（收稿日期：2007-09-05）

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