分子生物学诊断技术的应用(二)

中图分类号:S854.4+3文献标识码:B文章编号:1007-273X(2010)10-0004-04

3核酸扩增技术-聚合酶链反应(PCR)

核酸扩增包括聚合酶链反应、连接酶链反应和Qβ复制酶技术等,根据实际应用情况,主要介绍聚合酶链反应。

3.1PCR技术原理和过程

聚合酶链反应(Polymerase chain reaction,PCR)技术是在模板DNA、引物和4种脱氧单核苷酸存在的条件下,依赖于耐高温的DNA聚合酶的酶促合成反应。PCR以欲扩增的DNA作为模板,以和模板正常和负链末端互补的两种寡核苷酸作为引物,经过模板DNA变性、模板引物复性结合并在DNA聚合酶作用下发生引物链延伸反应来合成新的模板DNA。模板DNA变性、引物结合(退火)、引物延伸合成DNA构成一个PCR循环。每一循环的DNA产物经变性又成为下一个循环的模板DNA。这样,目的DNA数量将以指数级别的形式扩增,在2h内可扩增30(n)个循环,DNA量可达原来的上百万倍。PCR三步反应中,变性反应在高温中进行,目的是通过加热使DNA双链解离形成单链;第二步反应又称退火反应,在较低温度中进行,它使引物与模板上互补的序列形成杂交链而结合上模板;第三步为延伸反应,是在4种dNTP底物Mg2+存在的条件下,由DNA聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应。通过高温变性、低温退火和中温延伸3个温度的循环,模板上介于两个引物之间的片段不断得到扩增。对扩增产物可通过凝胶电泳、Southern杂交或DNA序列分析进行检测。

3.2PCR反应条件和反应系统的组成

反应条件:PCR反应通过3种温度的交替循环来进行,一般94℃变性30s,55℃退火30s,70～72℃延伸30～60s,依此条件进行30次左右的循环。

PCR反应系统的组成:标准的PCR反应体系一般选用50～100μL体积,其中含有:50mmol/L KCl,10mmol/L Tris-HCl(室温,pH值4.3),1.6mmol/L MgCl2明胶或牛血清白蛋白(BSA),2种引物,各0.25μmol/L,模板DNA 0.1μg;Taq DNA聚合酶2.5IU。

PCR基本操作。一个典型的PCR反应可按以下步骤进行:将下列成分依序加入0.5mL灭菌离心管中并混匀:灭菌双蒸水30μL,10×扩增缓冲液10μL,4种dNTP混合物各16μL(每种浓度为1.25mmol/L),引物1.5μL(100pmol),引物2.5μL(100pmol),模板DNA 2μL,加灭菌双蒸水至终体积l00μL;置94℃加热5min;将0.5μL Taq DNA聚合酶(5IU/μL)加入反应混合液中;将100μL轻矿物油加入混合液表面,以防水分蒸发。按所设定的反应条件进行循环反应(在PCR仪上进行);反应终止后,取样品进行凝胶电泳,Southern杂交或DNA序列分析以鉴定是否得到特异的扩增产物。

3.3PCR衍生技术

PCR可扩增双链DNA和单链DNA,并能以RNA为模板,进行反转录PCR(RT-PCR)以扩增cDNA。经不断发展和完善,已有多种衍生PCR技术:除反转录PCR外,尚有不对称PCR、反向PCR、锚定PCR、多重PCR、着色互补PCR、免疫PCR和套式PCR等。

反转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR):RT-PCR用于扩增RNA样品。在PCR体系中先引入反转录酶,将RNA反转录获得cDNA,再以cDNA作为PCR的模板,加入引物和Taq DNA聚合酶按正常PCR方式扩增cDNA。这一技术广泛应用于RNA扩增和RNA病毒的检测。

锚定PCR(Anchored PCR):通常进行的PCR试验必须知道欲扩增DNA或RNA中段两侧的序列,并以此为依据设计引物进行PCR。当欲扩增的片段序列未知时,可通过锚定PCR进行扩增。其基本方法是分离细胞总RNA或mRNA并经反转录合成cDNA,通过DNA末端转移酶在cDNA 3′端加上同源多聚物(polyd G)尾,通过与其互补的锚定引物(polyd C)来保证扩增反应的特异性。

反向PCR(Inverse PCR):常规PCR是扩增两个已知序列之间的DNA片段,反向PCR则用于扩增位于已知序列的两侧的一段未知序列。方法是使含已知序列和未知序列的DNA片段环化,再用限制性内切酶切开已知序列,这样线性化的原位于已知序列两侧的未知序列变为位于已知序列之间,再经常规PCR操作就可大量扩增未知序列。

不对称PCR(Asymmetric PCR):不对称PCR又称单链扩增PCR。一般PCR反应中两种引物的量是相等的,不对称PCR中,两种引物的量相差悬殊,一般为50～100∶1,这样在生成一定数量的双链产物后,较少的引物就会被用完,大量生成一条单链的DNA,分离单链即可直接进行序列分析等研究。

多重PCR(Multiplex PCR):应用PCR技术可检测特定序列的存在或缺失。某些疾病的基因片段较大,且常有多处发生缺失或突变。用一对引物进行PCR检测时,扩增不到目的片段,此时就须使用多重PCR技术。在同一反应管中加入多对引物,扩增同一模板的多个片段,如果某一片段缺失,或扩增该片段的引物与被检核酸同源性太低,则在相应的电泳图谱上就无相应的正常片段出现,但可保证其他特异片段出现。目前报道的多重PCR反应,最多可同时扩增12条区带。当然,也可设计两对引物,分两次进行常规PCR。

着色互补PCR(Colour complementation assay):着色互补PCR又称荧光PCR(F1uroscent PCR)。其原理是用不同的荧光染料分别标记不同的寡核苷酸引物,通过多重PCR同时扩增多个DNA片段。反应结束后除去多余引物,扩增产物在紫外线照射下能显示某一种或几种荧光染料颜色的组合,如果某一DNA区带缺失,则会缺乏相应的颜色。通过颜色的有无及其组合可很快诊断基因的缺失、变异或发现某些感染的病毒基因等。这一技术为PCR技术的临诊自动化诊断打下了基础。

免疫PCR:免疫PCR即免疫多聚酶链反应(Immuno-PCR)。它是将高度灵敏的PCR技术与特异的免疫学方法相结合的一种新型的诊断技术,是目前最有希望的诊断方法。它的原理是通过DNA和抗体具有双重结合活性的连接分子使二者连接起来,这样就可以使作为指示系统DNA分子通过抗体而特异性地结合到抗原上,从而形成一种特异性“抗原-抗体-DNA复合物”,再通过对其中已知片段DNA的PCR扩增,即可证明抗原存在与否。这种方法的特点在于:①通过免疫捕获作用纯化检测对象;②用于检测的微生物无需事先明确其核酸序列;③该方法也适用于微生物以外的抗原检测,其前提条件是被检测对象具有良好的抗原性,并且备有其相对应的抗体;④无需根据不同对象设计不同的引物。被连接的已知片段DNA相当于指示剂,无论检测对象是什么,只需合成针对这段DNA的引物即可;⑤省去了普通PCR实验检测RNA病毒的反转录过程,既增加了灵敏度又降低了实验成本。这项技术的发明者Sano,T.等的试验表明,免疫PCR的灵敏度比ELISA方法高10万倍,足以检测出单个抗原分子。

套式PCR(Nested PCR):普通PCR的产物DNA往往需要再扩增,以便对之进行进一步鉴定、分子克隆或用作其他用途。此时,由于DNA产物的末端效应,用原来的那对引物难以实现再扩增的目的。如果在原来的引物内侧重新设计一对引物,再进行新一轮PCR反应,这种采用多对成套引物,逐步扩增DNA内侧片段的PCR就称为套式PCR。目前很多分子生物学实验室为了各自的研究需要都在应用这一技术。

3.4PCR技术用途

传染病的早期诊断和不完整病原检疫:在早期诊断和不完整病原检疫方面,应用常规技术难于得到确切结果,甚至漏检,而用PCR技术可使未形成病毒颗粒的DNA或RNA或样品中病原体破坏后残留的核酸分子迅速扩增而测定,且只需提取微量DNA分子就可以得出结果。

快速、准确、安全检测病原体:用PCR技术不需经过分离培养和富集病原体。一个PCR反应一般只需几十分钟至2h就可完成,从样品处理到产物检测,1d之内可得出结果。由于PCR对检测的核酸有扩增作用,理论上即使仅有一个分子的模板,也可进行特异性扩增,故特异性和灵敏度都很高,远远超过常规的检测技术,包括核酸杂交技术。PCR可检出fg水平的DNA,而杂交技术一般在pg水平。PCR技术适用于检测慢性感染、隐性感染,对于难于培养的病毒的检测尤其适用。由于PCR操作的每一步都不需活的病原体,不会造成病原体逃逸,在传染病防疫意义上是安全的。

制备探针和标记探针:PCR可为核酸杂交提供探针和标记探针。方法是:①用PCR直接扩增某特异的核酸片段,经分离提取后用同位素或非同位素标记制得探针;②在反应液中加入标记的dNTP,经PCR将标记物掺入到新合成的DNA链中,从而制得放射性和非放射性标记探针。

在病原体分类和鉴别中的应用:用PCR技术可准确鉴别某些比较近似的病原体。如蓝舌病毒与禽流感病毒。PCR结合其他核酸分析技术,在精确区分病毒不同型、不同株、不同分离物的相关性方面具有独特的优势,可从分子水平上区分不同的毒株并解释它们之间的差异。如新近建立的禽流感RT-PCR分子诊断技术。

此外,PCR技术还广泛应用于分子克隆、基因突变、核酸序列分析、肿瘤基因和抗癌基因以及抗病毒药物等研究中。

3.4PCR技术应用概况

从诞生至今约20年的时间里,PCR技术已在生物研究领域得到广泛的应用,将PCR技术用于动物传染病的检疫诊断研究也日趋广泛。例如,新西兰农渔部质量管理机构所属动物健康实验室(AHL)负责对各种外来疾病的疫情监测诊断,该室在1992年建立了几项PCR检测技术,包括从结核病病灶中快速检测牛分枝杆菌;快速检测患病牛羊中副结核分枝杆菌;检测恶性卡他热和新城疫等。

自1990年始,将PCR应用于动物传染病的诊断等研究的报道,可归纳如下。

快速诊断各类病毒病。用PCR成功进行检测的动物传染病病毒有:蓝舌病病毒、口蹄疫病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛白血病病毒、马鼻肺炎病毒、恶性卡他热病毒、伪狂犬病病毒、狂犬病病毒;非洲猪瘟病毒、禽流感病毒、禽传染性支气管炎病毒、禽传染性喉气管炎病毒、马传染性肺炎病毒、马立克氏病毒、牛冠状病毒、鱼传染性造血器官坏死病病毒、轮状病毒、鱼病病毒、水貂阿留申病病毒、山羊关节-脑炎病毒、梅迪-维斯纳病毒、猪细小病毒等。

由其他病原体引起的传染性疾病的研究。目前已报道的有致病性大肠杆菌毒素基因、牛分枝杆菌、炭疽杆菌芽孢、钩端螺旋体、牛巴斯虫和弓形虫等的PCR检测研究。在仪器微生物的检测中,PCR技术的应用也日益广泛。Homes等采用一种固相比色PCR技术成功检测了大肠杆菌热稳定肠毒素(STs)、IS(STIa)和Ib(STLb)基因。

4核酸电泳技术

核酸电泳包括聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和琼脂糖凝胶电泳等,简介如下。

4.1聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。核酸电泳是进行核酸研究的重要手段,是核酸探针、核酸扩增和序列分析技术等不可或缺的组成部分。核酸电泳通常在琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶中进行,浓度不同的琼脂糖和聚丙烯酰胺可形成分子筛网孔大小不同的凝胶,可用于分离不同分子量的核酸片段。

凝胶电泳操作简便、快速,可以分辨用其他方法(如密度梯度离心)所无法分离的核酸片段,是分离、鉴定和纯化核酸的一种常用方法。聚丙烯酰胺凝胶通过丙烯酰胺单体、链聚合催化剂N,N,N,N",N"-四甲基乙二胺(TEMED)和过硫酸铵以及交联剂N,N"-亚甲双丙烯酰胺之间的催化反应而形成。丙烯酰受单体在催化剂作用下次生聚合反应形成长链,长链经交联剂作用交叉连接形成凝胶,其孔径由链长和交联度决定。链长取决于丙烯酰胺的浓度,调节丙烯酰胺和交联剂的浓度比例,可改变聚合物的交联度。聚丙烯酰胺凝胶电泳根据电泳样品的电荷、分子大小及形状的差别达到分离目的,兼具分子筛和静电效应,分辨率高于琼脂糖凝胶电泳。可分离只相差1个核苷酸的DNA片段。聚丙烯酰胺凝胶电泳用于分析和制备长度小于1kb的DNA片段,根据所要分离的核酸片段大小,可制备不同浓度的凝胶。

凝胶的制备和电泳:由于氧能抑制丙烯酰胺的聚合反应,灌制聚丙烯酰胺凝胶常在两块封闭的玻璃平板所形成的夹层间进行。在这种装置形式下,仅有顶层的凝胶与空气中的氧气相接触,从而大大减少了氧对聚合的抑制作用。聚丙烯酰胺凝胶电泳一般采用垂直装置。

4.1.1材料与方法试剂配制:①30%丙烯酰胺:100mL双蒸水中含29g丙烯酰胺和1g N,N"-亚甲双丙烯酰胺。②5×TBE:每升溶液含5.4g Tris-HCl,2.75g硼酸和20mL 0.5mol/L EDTA(pH8.0)。③10%过硫酸铵:10mL双蒸水中含1g过硫酸铵。

凝胶的制备和电泳操作:将玻璃和垫条事先用去污剂刷洗,并经自来水和无离子水冲洗干净,晾干。装置时,将较大的玻璃板平放在工作台上,将两个垫条放在玻璃板两侧,涂上少量凡士林,并将上层玻璃板置于垫条上,用夹子将玻板连同垫条夹紧,底部用1%琼脂糖密封。为防止漏胶,除放梳子一边外,其余三边用防水胶带密封。根据玻璃板大小及夹层厚薄计算所需凝胶溶液量,计算配制溶液(100mL)。将35μL LTEMED加入100mL混合液中,混匀,然后均匀连续注入两玻璃板空隙中,立即插入电泳梳,勿使梳齿下形成气泡;室温聚合1h,梳齿下出现折光带时,表明聚合反应已经完成。若凝胶不立即使用,可用纱布或滤纸(用l×TBE浸泡)包盖于凝胶顶部,置4℃保存1～2d;拔掉梳子,立即用水冲洗加样孔;除去底部胶带,将疑胶直立放入电泳槽。在上下两槽中灌好1×TBE溶液,驱尽凝胶底部附着的气泡。并用1×TBE溶液冲洗加样孔;将核酸样品与6×凝胶加样缓冲液混合,并加入凝胶加样孔中;接通电源,正极与下槽连接。电压一般控制在1.8V/cm。电压过高时凝胶产生的热量可造成DNA区带弯曲,甚至引起小DNA片段的解链;电泳毕,取下玻板和凝胶,放在工作台上,从夹层一角轻撬,将上面的玻板轻轻移开,并小心揭下凝胶,置染色液中染色并进行结果观察。

4.1.2凝胶的染色和观察聚丙烯酰胺凝胶中核酸带的染色,常用溴化乙锭法和银染法。前者与琼脂糖凝胶的染色方法相同。银染法的灵敏度较高,可如下操作:将凝胶置固定液(10%乙醇、0.5%冰醋酸)中固定10min;双蒸水洗1～2次;置0.01mol/L AgNO3溶液中,室温反应15～30min;充分水洗;置NaOH-甲醛混合液(200mL 3%NaOH,含1mL甲醛)中反应至条带显色清晰,本底适宜;用5%冰醋酸终止反应。

4.2琼脂糖凝胶电泳

琼脂糖是从海藻中提取出来的一种线状高聚物。将琼脂糖在所需缓冲液中加热熔化成清澈、透明的溶胶,然后倒入胶模中,凝固后将形成一种固体基质,其密度取决于琼脂糖的浓度;将凝胶置电场中,在中性pH值下带电荷的核酸通过凝胶网孔向阳极迁移,迁移速率受到核酸的分子大小、构象、琼脂糖浓度、所加电压、电场、电泳缓冲液、嵌入染料的量等因素影响。在不同条件下电泳适当时间后,大小、构象不同的核酸片段将处在凝胶不同位置上,从而达到分离的目的。琼脂糖凝胶的分离范围较广,用各种浓度的琼脂糖凝胶可分离长度为200bp至50kb的DNA。

4.2.1材料仪器设备应包括水平凝胶电泳槽及其配套电泳梳、稳压电泳仪、微波炉或普通电炉。同时配备紫外线检测仪和照相系统。试剂包括琼脂糖、电泳缓冲液、溴化乙锭溶液、凝胶加样缓冲液。

电泳缓冲液常用TBE(1 000mL中含5.4gTris,2.75g硼酸,2mL 0.5mol/L EDTA,pH8.0)。

溴化乙锭(ethidium bromide,EBO)是一种荧光染料,它可以嵌入核本双链的配对碱基之间,在电泳过程中随核酸片段迁移,将凝胶置紫外光下,插入核酸链中的EB在紫外线激发下产生红色荧光,可清楚显示各核酸片段的迁移。EB见光易分解,应存棕色试剂瓶中于4℃下保存。由于EB是一种强的诱变剂并有中度毒性,使用时必须戴手套操作。

4.2.2操作方法用透明胶将玻璃板或电泳装置所配备的胶板的边缘圈封,制成胶模,置水平工作台上;称取适量琼脂糖,置电泳缓冲液中,加热使琼脂糖溶解;待溶液冷至60℃,加入10mg/mL EB贮存液浓度达0.5mg/mL;在距离胶模底板0.5～1.0mm处放置电泳梳,将琼脂糖溶液倒入胶模中,厚度为3～5mm,注意避免产生气泡;凝胶完全凝固后,移去梳子和透明胶,将凝胶放入电泳槽。加入TBE缓冲液使恰好过胶面约lmm;将DNA样品与1/6体积加样缓冲液混合后,加入样品槽中;接通电源,使样品槽在负极端,用1～5V/cm的电压,电泳适当时间;电泳结束后,可将含EB的凝胶直接放在紫外线检测仪上观察,并拍照记录,也可将不含EB的凝胶在0.5μg/mL的EB溶液中染色30～45min,再如上观察和拍照,记录结果。

凝胶摄影:可使用凝胶自动处理系统进行。

4.2.3注意事项EB溶液的净化处理:由于EB具有一定的毒性,实验结束后,应对含EB的溶液进行净化处理再行弃置,以避免污染环境和危害人体健康。对于EB含量大于0.5μg/mL的溶液,可如下处理:将EB溶液用水稀释至浓度低于0.5μg/mL;加入一倍体积的0.5mol/L K2MnO4,混匀,再加入等量的25mol/L HCl,混匀,置室温数小时;加入一倍体积的25mol/L NaOH,混匀并废弃。EB含量小于0.5μg/mL的溶液可如下处理:按1mg/mL的量加入活性炭,不时轻摇混匀,室温放置1h;用滤纸过滤并将活性炭与滤纸密封后丢弃。